[发明专利]细胞色素P450单加氧酶在催化石胆酸生产熊去氧胆酸中的应用

说明书

本发明公开了一种细胞色素P450单加氧酶在催化石胆酸生产熊去氧胆酸中的应用。本发明提供的细胞色素P450单加氧酶作为催化剂在石胆酸制备熊去氧胆酸的应用中，立体和区位选择性好，底物浓度高，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大。因此，本发明所述细胞色素P450单加氧酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种细胞色素P450单加氧酶在催化石胆酸生产熊去氧胆酸中的应用。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)，化学名为3a,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，为白色粉末状固体，分子式为C₂₄H₄₀O₄，分子量为392.57，CAS号为128-13-2，熔点为203℃，沸点为547℃，几乎不溶于水。

熊去氧胆酸已被广泛应用于医药领域，用于治疗治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎、眼部疾病等。熊去氧胆酸的合成有化学法和生物法两种。其中化学合成法一般采用从胆酸出发七步合成或从非胆酸类甾体出发来完成熊去氧胆酸的制备，此两种方法都存在反应收率低、产物纯度低、生产成本高的缺点，难以工业化生产。与化学法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、经济和环境效益较高等优点。生物法包括动力学拆分和合成。

生物合成法研究较多的是用野生菌或重组工程菌的整细胞或游离酶进行催化。Catherine Juste等报道了从人体排泄物中分离得到的五种菌都能将鹅脱氧胆酸转化为熊去氧胆酸，经过基因序列比对确定这五种菌都是Clostridium baratii。五种菌在培养48h后，熊去氧胆酸最高产率为75.9％，最低产率为52.0％；Ian A.Macdonald等人成功分离8种野生菌(Clostridium absonum)，它们都同时包含7α-和7β-HSDH，利用这些野生菌能将胆酸转化成熊胆酸或将鹅脱氧胆酸转化成熊脱氧胆酸。但是整细胞转化胆酸或鹅脱氧胆酸的浓度分别低于1.5mM和0.5mM，更高浓度则会抑制细胞生长和底物转化。分别培养15-22h和9-15h后产率为60-70％；Sergio Riva等报道了从胆酸一锅煮合成12-羰基-熊去氧胆酸的方法，反应中混合了五种酶，其中三种酶是：7α-HSDH克隆自B.fragilis菌株、12α-HSDH来源于未知序列的商业途径和7β-HSDH克隆自C.absonum，其中前两种酶起氧化作用，属于NADH依赖型，7β-HSDH起氧化作用，属于NADPH依赖性，通过不同的辅酶依赖性，结合不同的辅酶循环实现一锅煮。为了NAD⁺的再生，采用了乳酸脱氢酶/丙酮酸系统，同样为了NADP⁺的再生，采用了来源于Thermoplasma acidophilum的高度NADPH依赖性的葡萄糖脱氢酶。反应5h之后胆酸完全转化为12-羰基-熊去氧胆酸，但是24h之后又有中间产物出现，所以没有实现真正的一锅煮。

然而，以上方法仅限于实验室规模，且存在羟化酶的自身活力低，产物浓度不高，步骤繁琐以及酶热稳定性差等缺陷，不适合工业化生产熊去氧胆酸。因此，筛选活力高，且能在较短时间内获得较高产物浓度的细胞色素P450单加氧酶，以满足工业化生产熊去氧胆酸的需求具有非常重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有的生物催化制备熊去氧胆酸的反应中，酶活力偏低、步骤繁琐和产物浓度不够高的缺陷，开发了从石胆酸一步羟化法合成熊去氧胆酸的简短合成路线，并提供一种具有优异的催化活性的细胞色素P450单加氧酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及重组酶和该重组酶的制备方法，以及该细胞色素P450单加氧酶的应用。

本发明的第一个目的是提供了一种细胞色素P450单加氧酶在催化石胆酸生产熊去氧胆酸中的应用，所述的细胞色素P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的细胞色素P450单加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。