[发明专利]一种用于治疗膝骨关节炎的间充质干细胞制剂及其研究方法

说明书

本发明公开了一种用于治疗膝骨关节炎的间充质干细胞制剂及其研究方法，包括制备血小板裂解液、人脐带MSCs分离及培养、人脐带MSCs移植和疗效评定。本发明的有益效果是：确保制备细胞的活性，保证细胞存活数量可以用于实验研究，且防止部分细胞残余在培养瓶内，提高细胞计数的准确性，确认了MSCs治疗能明显改善膝骨关节炎患者疼痛，且效果优于传统的透明质酸治疗法，根据实验数据，可以选出最佳治疗次数，为今后在人脐带间间充质干细胞治疗膝骨关节炎提供科学依据。

技术领域

本发明涉及一种间充质干细胞制剂研究方法，具体为一种用于治疗膝骨关节炎的间充质干细胞制剂及其研究方法，属于化学医疗技术领域。

背景技术

骨关节炎是一种严重危害人类健康的慢性骨关节疾病，细胞治疗骨关节炎近年来发展较快，并得到了广泛关注，脐带来源的间间充质干细胞治疗骨关节炎既具有其他来源间间充质干细胞扩增分化容易，具有抗炎和招募作用等优势，又具有细胞年轻化、获得量大、无伦理问题、取材过程无痛苦、高增殖特性、多能分化特性、低免疫源性、无致瘤性等特点，是目前临床细胞治疗最常用的种子细胞。

间间充质干细胞 中间间充质干细胞治疗骨关节炎的优势在于具有组织来源广泛、扩增分化容易、分化的细胞具有组织特异性、具有抗炎和招募作用、低成瘤风险、免疫原性低等特点，但目前的临床随机对照试验数量有限，尚需要进一步的临床研究证实其疗效。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种用于治疗膝骨关节炎的间充质干细胞制剂及其研究方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种用于治疗膝骨关节炎的间充质干细胞制剂及其研究方法，包括以下步骤：

步骤A：制备血小板裂解液，取患者静脉血300ml后，离心获取血小板裂解液，-80℃低温保存，备用；

步骤B：人脐带MSCs分离及培养，在超净台内将脐带用无菌生理盐水冲洗干净，剪成小于1mm³的组织块碎后放入离心管中，将组织块平铺于10个T75培养瓶底部，加入含无血清培养基，置于37℃、含5%二氧化碳饱和湿度的恒温培养箱中，6天后培养液全量换液一次，镜下观察是否有细胞从组织块周围爬出，以后每3天换液一次，直至可见细胞爬出且密度达70-80%，可以考虑进行传代操作；

步骤C：人脐带MSCs移植，将受试者随机分为治疗组和对照组各10例，两组在性别构成、年龄及病程等方面无显著学差异，治疗组每月注射2×10⁷cells/4mL，连续注射3个月，对照组进行玻璃酸钠25mg膝关节腔注射治疗，期间获取关节液；

步骤D：疗效评定，进行WOMAC总评分和膝关节lequesne指数评分。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤B中，细胞镜下观察生长且密度达70-80%时，开始进行传代操作，轻轻拍打培养瓶侧壁，使组织块完全脱落下来，将含有组织块的培养上清液弃掉，用PBS冲洗培养瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL预热的0.05%胰酶，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，4℃离心5min，收集细胞，并计数，以5×10³/cm2的接种密度进行传代。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤C中，每次移植前1周关节腔注射4ml解冻后激活的血小板裂解液，移植前选择存活率不低于90%，且无EBV、HBV、HCV、HIV污染的细胞进行复苏且临用前行胰蛋白酶收集、激活的血小板裂解液重悬处理后混匀分装。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤C中，在进行膝关节注射时，常规消毒、铺洞巾，持5ml无菌注射器进入关节腔后抽出适量关节液，保留针头，拔出针筒，连接上装有混匀MSCs的针筒，缓慢注4ml，术毕无菌纱布压迫覆盖针眼，仰卧20min，期间间断屈伸膝关节数十次，MSCs移植1晚后再次注射4ml解冻后激活的血小板裂解液。