[发明专利]特异性识别N-乙酰神经氨酸的ssDNA适配体及其应用

说明书

本发明涉及特异性识别N‑乙酰神经氨酸的ssDNA适配体及其应用，通过磁珠‑SELEX技术筛选得到4条能够与Neu5Ac高特异结合的ssDNA适配体序列，其中ap1亲和力和特异性最高，结构稳定。在ap1序列基础上根据二级结构以及分子模拟对接结果对该序列进行截短，得到1条序列长度为21nt的适配体ap2，亲和力与截短之前相比有所提升。本发明的ssDNA适配体与Neu5Ac结合的特异性和亲和力较高，应用于Neu5Ac检测时灵敏度高。

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域，尤其涉及特异性识别N-乙酰神经氨酸的ssDNA适配体及其应用。

背景技术

N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是研究最多、最深入的唾液酸，它是合成其他种类唾液酸的前体。唾液酸作为糖缀合物的重要组成部分，其所携带的负电荷能促进细胞之间的相互排斥，起到稳定细胞膜，增加偶联糖蛋白粘度的作用等。唾液酸同时还是重要的生物信息传递分子，如参与识别宿主与病原体之间以及细胞之间的反应、参与巨噬细胞对衰老红细胞的吞噬作用等。先前已经证明，一方面，糖蛋白中Neu5Ac的异常表达与各种癌症密切相关；另一方面，癌症患者血浆中游离唾液酸以及脂质和蛋白质结合的唾液酸的数量高于健康个体。经研究还发现唾液酸是大脑神经节苷脂的重要组成部分，它们在大脑中信息的传递和存储中起着至关重要的作用，而且Neu5Ac在大脑发育以及细胞膜，膜受体和亚细胞器的正常功能中起到十分重要作用。因此，如何准确识别Neu5Ac并进一步对Neu5Ac单体及其修饰的生物大分子进行追踪检测，对于疾病的诊断和治疗都有很大的帮助。

目前国内外报道Neu5Ac的检测方法主要有高效液相色谱法、极谱分析法、分光光度法、薄层色谱法、化学发光法、免疫分析法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法、光谱法、伏安法等。仪器分析方法灵敏度高，准确性好，但设备昂贵难以普及，对实验人员要求较高，对样品的预处理比较复杂，并且分析费时，难以满足轻便高效的现场检测。免疫分析法检测Neu5Ac的主要方法是酶联免疫法。酶联免疫法是利用结合抗体抗原免疫反应与酶催化反应检测Neu5Ac，通过抗体(抗原)与酶结合形成酶标记复合物，酶标记复合物在相应的底物中催化反应，通过电信号、光信号或肉眼识别达到检测目的的检测分析技术。目前市场上已有一些针对Neu5Ac残留检测的ELISA试剂盒产品，不过价格昂贵，酶标抗体的种类有限，并且由于Neu5Ac是小分子化合物，本身不具有免疫原性，生产与应用存在较多的限制。这些都在很大程度上限制了免疫分析方法在Neu5Ac检测中的应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了特异性识别N-乙酰神经氨酸的ssDNA适配体，稳定性强，能够与Neu5Ac高特异结合，且亲和力较高。

本发明的一种特异性识别N-乙酰神经氨酸的ssDNA适配体，核苷酸序列为SEQ IDNO.1-5所示序列(ap1-5)之一。

以上ap1和ap3-5序列中，ap1序列亲和力最高。根据二级结构以及分子模拟对接的结果，ap1序列与Neu5Ac的结合位点全部集中在随机序列N35区域，缩短二级结构茎区长度，得到一段长度为21nt的ssDNA适配体，即ap2序列，亲和力有所提升。对适配体序列进行截短优化，保留其与靶分子结合的位点，删除大量冗余序列，能够大大降低合成成本。

进一步地，ssDNA适配体的3'端或5'端修饰有功能基团或分子。

进一步地，功能基团或分子为荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物、亲和配基或巯基。功能基团或分子用于提高适配体的稳定性、提供检测信号，或者用于连接适配体与其他物质形成组合物。

本发明还要求保护上述ssDNA适配体在Neu5Ac检测中的应用。

一种用于检测Neu5Ac的组合物，包括上述ssDNA适配体中的一种或多种。

一种用于检测Neu5Ac的试剂盒，包括上述ssDNA适配体中的一种或多种。