[发明专利]一种提高组织工程前板层角膜上皮细胞粘附力的方法

权利要求书

1.一种提高组织工程前板层角膜上皮细胞粘附力的方法，包括上皮细胞扩增步骤和前板层角膜构建步骤，其特征在于：所述上皮细胞扩增包括：前处理、消化和贴壁培养；所述前板层角膜构建包括：涂布、接种和两阶培养；其中，

所述前处理是指将新鲜动物角膜缘组织去除巩膜、虹膜、结膜组织和内皮层，保留上皮细胞、前弹力层和部分基质层，再用Hank液清洗以适于消化步骤；

所述消化包括用胰酶对上皮细胞和前弹性层进行消化，以使角膜上皮细胞游离；

所述贴壁培养包括将游离的角膜上皮细胞置于第一培养液中进行贴壁扩增培养；

所述涂布包括将涂布液涂布在脱细胞角膜支架材料的前弹力层上；所述涂布液为层黏连蛋白、纤维连接蛋白或胶原蛋白中的一种或多种；

所述接种包括在涂布后的角膜前弹力层上接种经贴壁扩增培养的上皮细胞；

所述两阶培养包括将接种后的角膜前弹力层先浸没于第二培养液中进行第一阶培养，再用第二培养液进行气液面培养完成第二阶培养，制得组织工程前板层角膜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Hank液含有青霉素100U/mL和/或链霉素100μg/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述涂布液中层黏连蛋白和/或纤维连接蛋白和/或胶原蛋白的浓度为10-15μg/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一培养液含有10％-15％的胎牛血清的DMEM培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述贴壁培养的温湿度条件是：37℃，5％饱和湿度；或者，所述贴壁培养步骤每隔24h更换一次第一培养液，当细胞融合达到80％时，将细胞接种于新的第一培养液中进行传代培养。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述涂布步骤之前还包括：脱细胞角膜支架材料复水步骤，所述复水步骤使用的液体为含青霉素和/或硫酸链霉素的生理盐水。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述涂布步骤之后且两阶培养步骤之前还包括孵育步骤，所述孵育步骤的温湿度条件为：37℃，5％的CO₂饱和湿度。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述接种包括：在涂布后的前弹力层上接种(1-4)×10⁷个/mL的上皮细胞悬液，接种量为50μL。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一阶培养包括：将接种有上皮细胞后的角膜前弹力层在第二培养液中浸没培养5-7天，并且每48h更换一次第二培养液。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第二阶培养包括：将经过第一阶培养的接种有上皮细胞后的角膜前弹力层置于第二培养液中进行气液面培养7-15天，每隔2-3天更换一次第二培养液。