[发明专利]B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用

说明书

本发明提供一种B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用。所述十二聚体是将生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白与链霉亲和素按4:1的摩尔比偶联得到的。本发明提供的B淋巴细胞刺激因子十二聚体在刺激小鼠脾脏细胞增殖实验和人B细胞增殖实验中表现出明显优于BLyS蛋白的生物学活性，用于BLyS相关的中和抗体筛选时，具有检测窗口大，灵敏度高，实验重复性好等特点。

技术领域

本发明涉及生物技术和免疫学领域，具体地说，涉及一种B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用。

背景技术

B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS/B-cell activatingfactor, BAFF)是肿瘤坏死因子超家族成员之一, 主要表达于骨髓家族细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、恶性B细胞等。B淋巴细胞刺激因子在这些细胞膜表面以三聚体形式表达，再经Furin蛋白酶切割后释放到微循环中，进而与B细胞膜表面的受体结合。BLyS主要有三个受体，跨膜活化子和CAML作用子(transmembrane Activator andCAML Interactor, TACI)、B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)和B细胞活化因子受体(B cell-activating factor receptor, BAFF-R)，这三个受体分别表达于不同发育时期的B细胞表面，BLyS与不同的受体结合介导着不同的生物学功能。BAFF-R主要表达过度期B细胞，包括滤泡(follic-lar，FO) B细胞、边缘区(marginal zone，MZ) B细胞上，BLyS与它的结合具有高度特异性和高亲和力，二者结合调节B细胞的存活，发育和分化。而BCMA和TACI 则主要表达在活化B细胞、记忆B细胞和浆细胞的膜表面，与BLyS能识别的同时还与TNF配体超家族的另一成员增殖诱导配体(APRIL)也能相互识别，并且结合的亲和力更高。与BAFF-R不同，BCMA和TACI与炎症反应和先天免疫相关。

研究表明，BLyS的过表达与系统性红斑狼疮、类风湿关节炎及干燥综合征等自身免疫疾病密切相关，在这些疾病患者血清中，BLyS水平明显上调。目前针对BLyS的抗体药已经应用于这些疾病的治疗，并取得显著治疗效果。例如GSK的Belimumab用于治疗红斑狼疮，治疗组有效比例超过50%，疾病复发更新减低50%，也可明显降低患者对糖皮质激素的依赖。诺华的Ianalumab是结合BAFF-R的，主要针对自身免疫性肝炎，类风湿关节炎、干燥综合征和系统性红斑狼疮等适应症，已进入临床二期试验，针对慢性淋巴细胞性白血病适应症进入临床一期试验。在这些抗体药的筛选过程中，常用的体外筛选方法就是检测其对BLyS生物学功能的影响，如B细胞增殖实验，B细胞分泌细胞因子实验。尽管BLyS在天然状态下就是三聚体形式存在，但它与受体结合能力并不高，因此在这些分析实验中检测窗口较低且灵敏度差。

发明内容

本发明的目的是提供一种高活性的B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种B淋巴细胞刺激因子十二聚体（BLyS十二聚体），所述十二聚体是将生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白与链霉亲和素按4:1的摩尔比偶联得到的。

其中，生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白是将如SEQ ID NO:1所示的B淋巴细胞刺激因子截短体蛋白的3个重复序列通过柔性Linker串联并在C端修饰生物素得到的。

优选地，本发明中使用的柔性Linker为GGGSGGG。

在本发明的一个具体实施方式中，B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i）如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

ii）在i）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或