[发明专利]一种检测CD47的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种检测CD47的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用。本发明的酶联免疫试剂盒，包括碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体、样品稀释液、酶标板、CD47标准品梯度溶液、酶标抗体稀释液、20×浓缩洗涤液、显色剂和终止液。本发明采用了碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体，以碱性磷酸酶标记替代传统辣根过氧化物酶标记，引入了纳米金和双抗(辅助抗体/抗体)，通过多次信号放大方法，显著提高了试剂盒的稳定性和检测灵敏度。另外，碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体引入了价格低廉易获得的辅助抗体aMab2，减少了Mab2的用量，极大地降低生产成本。

技术领域

本发明属于医学检测试剂盒技术领域，具体涉及一种检测CD47的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

CD47，又称为整合素相关蛋白(integrin-associated protein，IAP)，是免疫球蛋白超家族(immunoglobulins superfamily，IgSF)中的重要成员，是一种跨膜糖蛋白，具有氨基末端免疫球蛋白结构域和羧基末端多重跨膜区域。

CD47主要参与两个重要的生理功能：(1)CD47与信号调节蛋白(signal-regulatory proteinα，SIRPα)的相互作用，CD47通过与巨噬细胞上表达的SIRPα受体结合，导致酪氨酸磷酸酶活化并抑制吞噬突触位点肌球蛋白的积聚，对巨噬细胞发送一个“别吃我”信号，发挥抗吞噬的作用。CD47的高表达增强了这个信号，从而限制了巨噬细胞的吞噬清除能力，低表达或不表达CD47的细胞可更好的被巨噬细胞清除。CD47几乎在所有肿瘤细胞表面过度表达，使得肿瘤细胞逃避巨噬细胞的吞噬作用；(2)CD47作为TSP-1信号传导的受体，TSP-1是一种基质细胞蛋白，在细胞外基质中表达，并通过细胞外表面受体和细胞外基质的其他成分相接触来调节细胞的功能，血管组织中的内源性TSP-1水平在血浆中具有重要的病理生理功能；在与TSP-1结合后，CD47可转导信号，改变细胞中钙离子、环核苷酸、整合素和生长因子信号，并控制细胞的活力和应激性。CD47通过与胞外、胞内以及其他的跨膜蛋白的横向相互作用发挥不同的功能，介导了不同的信号转导通路，CD47的表达量在肿瘤、血管类疾病、自体免疫性疾病等多种疾病中发挥着重要作用。研究发现，乳腺癌、胃癌、肺癌等患者肿瘤细胞、骨髓及外周血CD47均过量表达，较正常人群发生了2-10倍上调。因此，检测人体内CD47的含量，可以作为临床辅助诊断癌症的依据，具有潜在的临床应用价值。有研究进一步表明，肿瘤细胞、骨髓或外周血中CD47的高表达，是一种不利的预后因素，可以通过检测CD47的表达量，预判患者的治疗效果。因此，开发一款可以准确检测CD47含量的试剂盒是非常有必要的。

目前，文献上很少有报道关于CD47检测的试剂盒，市场有售的CD47酶联免疫试剂盒多采用辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，其稳定性较差，灵敏度较低，且成本较高。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测CD47的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用，本发明中的试剂盒是以碱性磷酸酶(ALP)标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体(aMab2-GNP-Mab2)检测CD47的酶联免疫试剂盒，该试剂盒操作简便、结果稳定、灵敏度高，具有临床诊断的潜在应用价值。

术语说明：

ALP：碱性磷酸酶。

BSA：牛血清白蛋白

Mab1：CD47单克隆抗体1。

Mab2：CD47单克隆抗体2。

aMab2：碱性磷酸酶标记的β-Actin单克隆抗体。

GNP：金纳米粒子，通常是指直径为0.8-250nm金的固体微粒。

PNPP：对硝基苯磷酸二钠。