[发明专利]一种用于遗传毒性评估的集成化三维折纸器件与应用

权利要求书

1.一种集成化三维折纸器件，其特征在于，所述集成化三维折纸器件用于检测基因组DNA的3’-OH末端断裂类型损伤及评估污水或污染物样品遗传毒性；所述集成化三维折纸器件包括加样区器件(1)、标记试剂储存区器件(2)和废物吸收垫(3)，加样区器件(1)与标记试剂储存区器件(2)相连并可通过连接处折叠，加样区器件(1)和废物吸收垫(3)相连并可通过连接处折叠；所述加样区器件(1)上设有加样区(4)，标记试剂储存区器件(2)上设有标记试剂储存区(5)；加样区器件(1)与标记试剂储存区器件(2)沿相连处对折后，加样区(4)和标记试剂储存区(5)在位置上相对应；所示加样区器件(1)和标记试剂储存区器件(2)上除加样区(4)和标记试剂储存区(5)以外的区域为疏水区，加样区(4)、标记试剂储存区(5)和废物吸收垫(3)为亲水区；所述加样区(4)包被细胞裂解液，所述标记试剂储存区(5)包被包含了末端脱氧核苷酸转移酶、FITC-dUTP和普鲁兰糖的标记试剂。

2.根据权利要求1所述的一种集成化三维折纸器件，其特征在于，所述加样区器件(1)的材质包括Whatman Grade 1滤纸、Whatman Grade 5滤纸或Millipore Glass fiber滤纸；标记试剂储存区器件(2)的材质包括纤维素滤纸；废物吸收垫(3)的材质包括滤纸。

3.根据权利要求1所述的一种集成化三维折纸器件，其特征在于，加样区(4)和标记试剂储存区(5)的形状包括圆形。

4.根据权利要求1所述的一种集成化三维折纸器件，其特征在于，所述标记试剂为普鲁兰糖、末端脱氧核苷酸转移酶与FITC-dUTP的混合溶液，FITC-dUTP与末端脱氧核苷酸转移酶物质量的比值大于500，普鲁兰糖终浓度10％(m/v)。

5.根据权利要求1所述的一种集成化三维折纸器件，其特征在于，加样区器件(1)和标记试剂储存区器件(2)采用喷蜡打印机打印除加样区(4)和标记试剂储存区(5)以外的区域，将加样区器件(1)和标记试剂储存区器件(2)加热至120-130℃，加热2-3min使蜡融化并渗透整个纸器件的厚度，形成疏水区。

6.权利要求1-5中任一项所述的一种集成化三维折纸器件的应用，其特征在于，在检测基因组DNA的3’-OH末端断裂类型损伤及在评估污水或污染物样品遗传毒性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取暴露于污水或污染物中培养的动物的细胞或使用污染物暴露处理细胞，制备得到待检测的细胞悬浮液；

(2)将避光保存的集成化三维折纸器件平铺，使加样区器件、标记试剂储存区器件和废物吸收垫处于同一平面上；向加样区中加入待检测的细胞悬浮液，室温孵育，进行细胞裂解；

(3)将废物吸收垫折叠到加样区器件的下方并与加样区器件紧密接触，向加样区加入1×PBS洗涤裂解废物，使裂解废物洗涤到废物吸收垫上，加样区保留所提取的基因组DNA；

(4)将废物吸收垫折叠到加样区器件的同一平面，标记试剂储存区器件折叠到加样区器件的上方并与加样区器件紧密接触，使加样区和标记试剂储存区位置上相对应，向标记试剂储存区加入ddH₂O，使标记试剂储存区的标记试剂洗涤到加样区，室温孵育后，向标记试剂储存区加入乙二胺四乙酸，使乙二胺四乙酸进入加样区以终止反应；

(5)将标记试剂储存区器件折叠到加样区器件的同一平面，将废物吸收垫折叠到加样区下方并与加样区器件紧密接触，加样区用1×PBS洗涤，使未标记的FITC-dUTP洗涤到废物吸收垫上，洗涤完成后，将废物吸收垫折叠到加样区器件的同一平面上；

(6)对加样区进行拍照检测荧光强度，对反应区的荧光强度扫描并定量，以实现基因组DNA的3’-OH末端断裂类型损伤的检测，以评估污水或污染物样品遗传毒性。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中孵育的时间为2-5min，步骤(4)中孵育的时间为5-30min。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)所述动物包括斑马鱼，所述细胞包括斑马鱼肝细胞。