[发明专利]一种变形假单胞菌转录因子LexA多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种变形假单胞菌转录因子LexA多克隆抗体的制备方法，其特征在于:包含以下步骤：

步骤(1)编码变形假单胞菌转录因子LexA的核酸碱基序列；

步骤(2)将人工合成LexA基因插入pET-32表达载体，并挑选阳性克隆测序验证,形成重组的质粒；

步骤(3)将步骤(2)所述构建好的质粒转化BL21 DE3感受态细胞经过培养、诱导、裂解、离心，得到蛋白质菌株，采用SDS-PAGE检测蛋白表达情况；

步骤(4)选择步骤(3)中所得良好的菌株进行接种、培养、诱导、裂解、纯化，得到LexA蛋白，采用SDS-PAGE鉴定蛋白分子量、纯度及浓度；

步骤(5)以步骤(4)制备所得LexA蛋白质为抗原进行动物免疫；

步骤(6)采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清并纯化，即得LexA抗体。

2.根据权利要求1所述的一种变形假单胞菌转录因子LexA多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为：根据前期基因组测序所获得的变形假单胞菌LexA基因序列，人工合成LexA基因并将其插入pET-32表达载体中；pET-32表达载体为氨苄抗性，含有Trx标签及6xHis标签，Trx硫氧还蛋白标签有利于增强蛋白可溶性表达，在pET-32载体中位于目的基因的N-端，将构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α中，使用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，在37℃下培养12小时，挑取单菌落后摇菌，提取质粒并测序，测序正确的即为所需重组质粒。

3.根据权利要求1所述的一种变形假单胞菌转录因子LexA多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为：将步骤(3)构建好的重组质粒转化BL21 DE3感受态细胞，接种抗性LB平板培养基，生长24小时；挑选转化平板的6个单克隆，分别接种3ml抗性液体培养基；37℃温度中，培养至OD600nm值为0.5-0.6之间，加入0.5mM IPTG 20℃诱导表达3.5小时；离心收集菌体，超声破碎，SDS-PAGE检测表达情况。

4.根据权利要求1所述的一种变形假单胞菌转录因子LexA多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)具体为：选择步骤(3)表达良好的菌株接种60μl菌种至200ml抗性培养基中，在37℃中，培养24小时；加入新鲜抗性培养基至800ml，培养1-2小时，至OD600nm值为0.5-0.6之间；加入200μl的1M IPTG诱导表达3.5小时；4℃离心收集菌体，沉淀并废弃上方清液，加入30mlPBST悬浮菌体，加入终浓度1mM PMSF，冰浴条件下选用200W超声波破碎6min；摇床4℃孵育1小时；离心处理，取上部分清液，加入400μl镍柱4℃结合24小时；收集镍柱，20mM imidazole洗涤液洗涤beads，洗去杂蛋白；加入300ul 300mM imidazole洗脱液,让洗脱液与beads充分结合1小时，离心收集上部分清液；向beads中再次加入300μl的洗脱液，洗脱1小时，离心收集上部分清液，两次洗脱液合并加入一个试管；用PBS透析换液；SDS-PAGE鉴定蛋白质分子量，纯度及浓度。

5.根据权利要求1所述的一种变形假单胞菌转录因子LexA多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)免疫动物为2-3月龄日本大耳白Balb/C兔，免疫方法采用背部多点注射，免疫周期为64天。

6.根据权利要求1所述的一种变形假单胞菌转录因子LexA多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)抗血清制备方法具体为：以常规方法将1mg纯化蛋白质共价连接至溴化氢活化的Sepharose4B柱，制备亲和纯化柱；10ml抗血清与亲和纯化柱孵育24小时；pH5.0HCl预洗，除去杂抗体；pH2.5，0.15Mglycine缓冲液洗脱，10xPBS缓冲液中和，制备亲和纯化抗体；用PBS缓冲液透析换液，即得LexA抗体。