[发明专利]一株敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一株敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母由原始酿酒酵母利用CRISPR‑Cas9技术敲入基因Sic1后改造而成。由于原始菌株在固定化发酵中菌体聚集过多且聚集体不成熟，电阻较高，阻碍了传质传导，导致其发酵周期的加长，而敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显减弱，在固定化发酵中细胞粘附聚集情况减少，黏附性降低，游离细胞增多，加强了传质传导，缩短了发酵周期。

技术领域

本发明属于基因工程及微生物技术领域，具体涉及一株敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

生物膜也称为生物被膜，是一种由微生物细胞和其分泌的胞外基质共同组成的生物聚集体，由微生物集群与其分泌出的多糖、蛋白、脂肪酸等形成膜状结构附着于载体表面。生物膜的存在，不仅作为屏障为细胞的生命活动创造了稳定的内环境，介导了细胞与细胞、细胞与基质之间的连接，而且还承担了物质转运、信息的跨膜传递和能量转换等功能，更重要的是，生物膜还作为一种重要的工业应用——固定化发酵。与游离细胞发酵相比，固定化发酵中所形成的生物膜能在发酵过程中表现出较高的底物耐受性和较快的发酵效率。通常条件下，常规的游离细胞发酵50g葡萄糖大约需要8h左右，而固定化细胞只需要6h就可以将糖转化为乙醇，展现了固定化细胞出色的发酵效率和发酵能力。但生物膜过多，会造成菌体聚集过多且聚集体不成熟，电阻较高，阻碍了传质传导，导致其发酵周期的加长。

成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，即CRISPR)II型系统是细菌免疫系统，现已被改造用于基因工程。CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内，CRISPR-Cas9技术风靡全球，成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的应用。

发明思路：酿酒酵母的周期素依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinaseinhibitor,Cki)Sic1是酵母细胞周期的关键调控因子，控制细胞进入S期，协调细胞生长和增殖。因此，本发明选取Sic1基因作为改造对象，构建酿酒酵母基因工程菌，以定向减弱菌株絮凝性及减少固定化发酵中生物被膜量，进而提高发酵效率和发酵能力。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株酿酒酵母基因工程菌，该菌株由向原始酿酒酵母敲入Sic1基因后改造得到，所述Sic1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae 1308，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 1308，可商购得到。

其中，所述Sic1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明利用CRISPR-Cas9系统进行基因改造。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：