[发明专利]一种高通量通过检测钙信号判断人精子质量的方法

说明书

本发明公开了一种高通量通过检测钙信号判断人精子质量的方法，属于医学技术领域。本发明基于群体精子样本生理环境下，对同一样本进行多种生理因素刺激下[Ca²⁺]_i变化高通量酶标仪检测，以大数据临床样本量对于各生理因子对[Ca²⁺]_i调节情况作为研究对象，通过选取精子在配子受精之前功能调控各个过程中相应的生理刺激，观察各个精子样本为准备受精过程中各个方面正常与否情况。

技术领域

本发明属于医学技术领域，具体涉及一种高通量通过检测钙信号判断人精子质量的方法。

背景技术

正常人成熟精子是一个形似蝌蚪状的长形细胞，分为头部、颈部、中段、主段和末段。由于哺乳动物成熟精子具有一个高度浓缩的细胞核，因而被认为是转录和翻译沉默的细胞，因此，精子生理功能的调控主要依赖于翻译后的蛋白修饰调节。基于胞内 Ca²⁺信号作为一种重要的第二信使，在该修饰调节过程中的关键作用，Ca²⁺在精子获能中扮演核心作用，在精子成熟、超活化运动、顶体反应、精卵结合等一系列精子生理功能的调控中也发挥着极其关键的作用。在体外实验研究细胞外Ca²⁺浓度对精子功能的影响时发现：获能液中含有0.22mM Ca²⁺就足够诱发人精子产生蛋白磷酸化反应与超活化运动，但要使精子发生顶体反应及精卵结合，获能液中的Ca²⁺浓度则必须达到0.58 mM。其中通过检测精子胞内Ca²⁺([Ca²⁺]_i)含量时也发现，获能精子[Ca²⁺]_i(100-300nM)明显高于未获能的精子(10-40nM)。获能精子[Ca²⁺]_i升高后，胞内大量的Ca²⁺将与膜磷脂以及许多的功能酶结合，从而修饰细胞膜生理特性、改变酶活性，从而改变精子功能，使精子超活化，进而发生顶体反应、促进精卵结合，完成受精过程，因此，其对成熟精子各种功能调控过程尤为重要。而目前关于 Ca²⁺库如何调控胞内Ca²⁺信号进而影响精子功能仍知之甚少。因此，建立一种合适的方法检测成熟精子胞内 Ca²⁺信号调控情况将有助于全面认识受精过程中的精子功能调节机制。

目前测定钙信号响应的筛选方法有：利用流式细胞仪测定人精子胞内钙浓度、单细胞钙成像技术等。但这些方法步骤繁琐，耗时较长，不能高效、高通量的筛选多种生理指标下对应的生理因子刺激的钙信号变化情况。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量通过检测钙信号判断人精子质量的方法，通过模拟生理环境下，对同一样本进行体外群体精子测钙，实现对不同生理因子刺激下的钙信号[Ca²⁺]_i变化荧光信号检测，以反映同一精液样本对于各生理因子对[Ca²⁺]_i调节情况，通过选取精子在配子受精之前功能调控各个过程相应生理刺激，反应精子为准备受精过程中各个方面正常与否情况。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种高通量通过检测钙信号判断人精子质量的方法，包括以下步骤：

步骤1，人精液样本的处理：将收集到的精液样本水浴液化；

步骤2，清洗纯化人精子：将步骤1的精液样本用HS清洗，以去除精浆；

步骤3，Fluo-4 AM精子孵育染色：采用钙荧光探针Fluo-4 AM 和Pluronic F-127对纯化后的精子进行染色；