[发明专利]一种2′-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法

说明书

本发明公开了一种2'‑岩藻糖基乳糖的富集纯化方法，使用浓缩的除菌体、除蛋白、除有机溶剂的发酵法生产的2’‑岩藻糖基乳的糖富集液制备2’‑岩藻糖基乳糖。本发明从发酵液中富集2’‑岩藻糖基乳糖的方法简单易行，经济高效，具有较高的回收率，从实验室到工厂只需按比例扩大体系即可，几乎不需要做其他任何改变。且在富集过程中不引入有毒有害物质，只使用了安全的去离子水和无水乙醇，可以保证富集液的安全性且利于下游纯化操作。

技术领域

本发明属于分离纯化领域，具体涉及一种2’-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法。

背景技术

临床调研表明，母乳喂养的婴幼儿在烦躁程度、哭闹时间、吐痰次数等劣性表观行为上要明显优于非母乳喂养的宝宝，甚至在上呼吸道感染、肺炎、尿道炎、过敏等幼儿常见疾病的患病频率上也显著低于非母乳喂养的。于是，母乳喂养被奉为抚养婴幼儿的圣经宝典，母乳的成分也被誉为婴幼儿食品的黄金标准。

最新研究表明，母乳喂养所带来的种种有益功能，都与母乳中的低聚糖成分息息相关。因此，作为母乳低聚糖中含量最高的2’-岩藻糖基乳糖(2’-Fucosyllactose，2’-FL)，自然成为了关注的热点。大量有关2’-岩藻糖基乳糖制备方法的文献与专利被陆续发表和刊登，有关人工合成2’-岩藻糖基乳糖安全性的研究也表明其具有较高的安全性，2’-岩藻糖基乳糖也相继在2015年和2016年获得FDA和欧盟的批准被纳入婴儿配方奶粉的合法成分。

随着化学和生物合成技术的不断进步，2’-岩藻糖基乳糖现已能够利用化学合成、酶法和生物合成法来进行工业化生产，但化学法生产存在诸多弊端，如合成步骤过多，副产物复杂，其反应体系需要大量有机溶剂，处理不当会对环境产生污染等；而酶法生产效率低，生产条件苛刻，工具酶生产本身就需要复杂的生产过程，且价格不菲；生物发酵生产的2’-岩藻糖基乳糖，相对于其他生产方法其产能高，易扩大，更安全，但由于发酵液成分复杂，分离制备难度高，目前常规采用的制备柱法纯化费用高昂，纯化成本占到了总生产成本的80％甚至更高。这导致2’-岩藻糖基乳糖发酵产业整体产能过低，且优质2’-岩藻糖基乳糖产物价格高昂，难以满足广大人民群众的需求。因此，找到一种廉价且高效的纯化方法，是降低2’-岩藻糖基乳糖生产成本以及提高2’-岩藻糖基乳糖整体产能的不二法门。

发明内容

本发明提供了一种从发酵液中富集及纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，且该方法快速高效且廉价。

一种2'-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法，使用浓缩的除菌体、除蛋白、除有机溶剂的发酵法生产的2’-岩藻糖基乳的糖富集液制备2’-岩藻糖基乳糖。

一种2'-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法，具体步骤如下：

1)活性炭层析柱预处理：用不锈钢筛网筛选30目到120目粉末状椰壳活性炭，将筛选好的活性炭用去离子水清洗10遍，直到水面澄清，置于105℃烘箱中过夜彻底烘干，烘干后加入20％的乙醇水溶液搅拌洗涤后弃去洗液，再加入60％乙醇水溶液搅拌洗涤后弃去洗液，最后使用无水乙醇搅拌洗涤后湿法装柱，装柱后用洗耳球轻击玻璃层析柱表面，加快活性炭填料沉降，静置过夜后逐级使用80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％乙醇水溶液和超纯水各平衡2-6个柱体积；

2)层析纯化2’-岩藻糖基乳糖：先用去离子水平衡活性炭层析柱2-6个柱体积，然后上样2’-岩藻糖基乳糖富集液，随后按照去离子水2-4柱体积，10％乙醇2-6柱体积，15％乙醇1-2柱体积的顺序洗脱杂质，再使用15％-35％乙醇水溶液2-6柱体积洗脱2’-岩藻糖基乳糖并收集，最后用80％乙醇洗脱2-6个柱体积再生填料；再生填料可以使用活性炭填料。

活性炭层析柱预处理一般用酸水和碱水处理活性炭目的是使得活性炭内部有机物变性，从而溶出，但由于活性炭自身强大的吸附力，这样不能完全从活性炭中洗脱溶出物，使用梯度乙醇来逐级降低活性炭的吸附力，从而在活性炭不同吸附力下分别洗脱干净，这对后续的层析极其重要。