[发明专利]一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法

说明书

本发明提供一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，利用同轴式生物3D打印，以氯化钙溶液作为内层，将甲基丙烯酸酐化明胶，海藻酸钠，聚乙二醇二丙烯酸酯及血管平滑肌细胞混合作为外层生物墨水，打印出的支架通过氯化钙和蓝外光照进行彻底交联，最后形成三位一体化可灌流支架，从而建立血运。在支架内灌注血管内皮细胞，模拟血管细胞成分。在三层支架上分别接种成纤维细胞，脂肪间充质干细胞，骨骼肌成肌细胞，分别加入成纤维细胞培养基，成脂诱导培养基及成肌细胞培养基并放置于反应器中进行培养，将三层支架进行折叠，通过鼠尾胶原进行粘接，形成堆叠式支架。本发明实现了血流的一体化灌注，不同细胞成分的独立培养分化以及组装。

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体是一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法。

背景技术

肌皮瓣是一种复合组织瓣，是利用身体某块肌肉(或一部分肌肉)连同其浅层的皮下组织、皮肤一并切取，以进入该肌肉的血管为蒂进行转移，用于较大创面缺损的修复或肌肉功能的重建。肌皮瓣的血液供应充沛，抗感染力强，易于成活，组织量丰富，是整形重建外科常用的组织瓣之一。

现有技术包括3D打印，模具成型等，但存在难以实现不同细胞成分的独立培养分化，难以实现血流的一体化灌注以及不同细胞组分的组装。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，具体包括如下步骤：

(1)以氯化钙溶液作为内层，将甲基丙烯酸酐化明胶，海藻酸钠，聚乙二醇二丙烯酸酯及血管平滑肌细胞混合作为外层生物墨水，设计串联的三个支架，利用生物3D打印机进行同轴打印；

(2)将步骤(1)打印出的支架通过氯化钙和蓝光光照进行彻底交联，最后形成三位一体化可灌流支架，从而建立血运，在支架内灌注血管内皮细胞，模拟血管细胞成分；

(3)在三个支架上分别接种成纤维细胞，脂肪间充质干细胞，骨骼肌成肌细胞，并放置于生物反应器的反应仓中进行分隔独立培养及一体化灌注；

(4)向步骤(3)中三个反应仓中分别加入成纤维细胞培养基，成脂诱导培养基及成肌细胞培养基培养7-14天，将三层支架进行折叠，通过鼠尾胶原进行粘接，形成堆叠式支架，继续培养7-21天，以促进三层融合，得到立体血管化肌皮瓣。

进一步的，所述步骤(1)中外层生物墨水的制备步骤如下：按照质量体积比将5％-8％甲基丙烯酰化明胶，1-3％海藻酸钠，10-15％聚乙二醇二丙烯酸酯和0.05-0.1％光引发剂LAP溶解在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，再加入血管平滑肌细胞，使细胞浓度为5*10⁶-10⁷个/mL。

进一步的，所述外层生物墨水制备好后储存在37℃直到使用。

进一步的，所述步骤(1)中CaCl₂溶液的浓度为25-75mM，采用双通道同轴系统打印三维管状结构，内层为CaCl₂溶液，使用20mL注射器，挤出速度为0.1mm-0.2/min，外层为生物墨水，使用5mL注射器，挤出速度为0.56-1.12mm/min。

进一步的，步骤(1)打印出的支架首先以CaCl₂溶液交联，然后暴露在蓝光下5-10min进一步交联。

进一步的，所述步骤(2)中在支架内灌注血管内皮细胞的具体步骤如下：通过留置针连接步骤(2)中所述的支架，向支架内通入0.5-1mL血管内皮细胞悬液，关闭留置针，将支架连接留置针静置于生物反应仓平板上，扣上生物反应仓上半部分，通过螺丝固定上下部分反应仓，调整螺丝松紧度，固定支架，放于5％CO₂培养箱中，待1.5-2h后将留置针打开连接橡胶管及培养瓶，培养瓶内装入F12K培养基，将橡胶管连接蠕动泵，设置灌注速度为200-300uL/min，然后运行蠕动泵进行动态灌注培养3-5天。