[发明专利]一种抗Ki-67特异性单克隆抗体及其应用

说明书

本发明涉及一种抗Ki‑67特异性单克隆抗体，其重链可变区具有如SEQIDNo：7所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQIDNo：8所示的氨基酸序列。该抗Ki‑67特异性单克隆抗体，编码所述抗Ki‑67特异性单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNo：5所示，编码所述抗Ki‑67特异性单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNo：6所示。本发明的Ki‑67抗体与人Ki‑67蛋白的结合具有特异性强、检测灵敏度高的特点。该抗体适合用于乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、宫颈癌等恶性肿瘤组织标本中的免疫组化检测中，可提高检测的准确度。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种抗Ki-67特异性单克隆抗体及其应用。

背景技术

Ki-67蛋白是一种与细胞增殖相关的核蛋白，与核糖体RNA转录相关，在维持细胞增殖中发挥关键作用。在细胞周期的G1，S，G2和M期均有表达，Ki-67蛋白在M期位于染色体表面，有丝分裂间期时仅表达于细胞核内，休眠(G0)细胞不表达Ki-67。

Ki-67指数，即组织中Ki-67染色的细胞百分比，表示生长分数。对于许多肿瘤，通过Ki-67免疫反应性评估的细胞增殖速率与肿瘤等级和临床病程相关。在乳腺癌中，通过Ki-67免疫反应性测量的增殖指数具有预后和预测价值。在非霍奇金淋巴瘤中，Ki-67标记指数大于5%的低度淋巴瘤相较Ki-67指数小于5%的预后更差。在胶质瘤中，低级别星形细胞瘤的Ki-67指数范围为0%至5%，而间变性星形胶质细胞瘤和胶质母细胞瘤最常见的Ki-67指数高于10%。在软组织肉瘤Ki-67指数与有丝分裂计数，细胞性和组织学分级正相关。在一些良性肿瘤，如脑膜瘤中，高Ki-67指数与高复发率相关。基于Ki-67指数在许多肿瘤等级评估、病程判断、预后和预测价值等方面的重要应用，获得一株灵敏度高，特异性好的抗Ki-67抗体对于分析Ki-67指数、肿瘤诊断至关重要。

发明内容

（一）要解决的技术问题

鉴于现有技术问题，本发明提供一种抗Ki-67特异性单克隆抗体，可被广泛应用和准确诊断各种类型的肿瘤、等级评估、病程判断、预后和复发率等预测。

（二）技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明提供一种抗Ki-67特异性单克隆抗体，其重链可变区具有如SEQID No：7所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ ID No：8所示的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供一种抗Ki-67特异性单克隆抗体，其编码所述抗Ki-67特异性单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNo：5所示，编码所述抗Ki-67特异性单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNo：6所示。

其中，用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1型单克隆抗体，亲和常数为6×10^-7(mol/L)。免疫组织化学实验显示，所述抗Ki-67单克隆抗体能够识别Ki-67蛋白，包括但不限于重组Ki-67抗原蛋白和肿瘤细胞表面的Ki-67分子等。

第三方面，本发明提供一种抗Ki-67单克隆抗体的制备方法，包括：

S1:免疫：分别用SEQ ID No：1-4所示的氨基酸序列的合成多肽作为免疫原，经由KLH或OVA偶联后，免疫不同的Balb/c小鼠，免疫后取血测定血清抗体效价，选取与各所述合成多肽一一对应的抗体效价最高的小鼠分别进行细胞融合；

S2:细胞融合：骨髓瘤细胞采用鼠来源的sp2/0鼠骨髓瘤样细胞，融合时处于对数生长期；取小鼠脾淋巴细胞与sp2/0鼠骨髓瘤样细胞进行细胞融合，于HAT培养基中培养，得到杂交瘤细胞；