[发明专利]生长因子PDGF-C在维持干细胞多能性的应用和促进干细胞多能性的培养方法及应用

说明书

本发明提供利用PDGF‑C促进干细胞多能性的培养方法，包括：1)直接在干细胞培养基中添加PDGF‑CC重组蛋白；2)表达PDGF‑C的质粒或病毒；3)在诱导性过表达PDGF‑C的干细胞中通过加入强力霉素诱导PDGF‑C的表达。PDGF‑C可以通过与PDGFRα受体结合，激活PDGFR通路，促进干细胞里多能性因子的表达，从而达到维持干细胞多能性的效果。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体地，涉及生长因子PDGF-C在维持干细胞多能性的应用和促进干细胞多能性的培养方法及应用。

背景技术

干细胞(stem cell，SC)是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的未分化细胞，在体内能够分化产生某种特定组织。由于干细胞的这两大特性，其在临床应用尤其是再生医学领域中具有重要的价值，成为再生与修复各种组织器官的重要材料。根据发生学来源分类，干细胞可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和成体干细胞(adult stemcells,ASCs)1。两者均为目前干细胞研究的热点领域，但ASCs缺乏分化成三个胚层的潜能，且来源和数量有限2。相比之下，来源于内细胞团的ESCs在体外可无限扩增，来源充沛。ESCs具有自我更新能力和多能性，即在体外培养可以无限增殖并且保持未分化的状态；同时可以多向分化，被诱导分化为几乎所有类型的细胞。

尽管经过了多种优化，现有的ESCs体外培养条件仍存在大量不足。比如，最常规和广泛使用的是含胎牛血清(FBS)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的培养基进行培养，其中LIF是必需的生长因子，能维持多种ESCs在没有饲养细胞情况下的自我更新。然而，如果ESCs长期养在血清+LIF的培养基中、不及时传代或换液，均容易引起细胞分化、细胞多能性丢失等问题。后续有研究发现，通过加入两种小分子抑制剂(2inhibitors,2i)：CHIR99021(抑制Gsk3α/β)和PD0352901(抑制Mek1/2)，可明显保持ESCs的原始不分化状态。因此，ESCs体外培养也会用血清+LIF+2i或完全2i培养基(基础培养基，加入2i，LIF，N2,B27等因子)。但是，尽管ESCs的状态得到了保持，这些培养条件比较复杂，所需因子很多，血清用量很大且成本昂贵，配置步骤较多对操作人员的要求也很高，容易造成污染，因此不利于目前ESCs的基础研究，也阻碍了对于ESCs大规模扩增的需求。因此，改进ESCs体外培养条件是目前亟待解决的问题之一，具有重要的科研价值，相关成果有助于未来对于ESCs的安全应用。

已有报道提出生长因子对ESCs的调控是非常精细的，ESCs发育均需要关键因子的精细调控。比如，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是已知的促人ESCs自我更新的关键因子。然而，低浓度的bFGF无法有效维持ESCs的未分化状态，但随着bFGF浓度增加又会降低ESCs的克隆形成能力。而目前的研究手段主要通过敲低/敲除等显著降低细胞内部特定因子的含量，这样可能会导致忽略了那些需要维持在适中含量的因子的作用。