[发明专利]基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法

说明书

本发明保健食品残留的检测方法，尤其涉及一种保健食品中左旋肉碱和右旋肉碱对映体的残留量的测定方法。该方法采用超高效合相色谱法拆分肉碱对映体，并测定了保健食品中左旋肉碱和右旋肉碱对映体的残留量。样品经无水乙醇超声提取，衍生化后，Acquity Trefoil CEL1手性色谱柱分离，以超临界二氧化碳‑1%(v/v)氨水甲醇等助溶剂为流动相进行梯度洗脱，外标法定量。结果表明，两种化合物在0.5~10.0 mg/L范围内线性相关系数大于0.999，定量限为50 mg/kg，回收率在89.2％~110％，相对标准偏差在4.3%~6.9％。本方法具有快速准确、分离效率高、重复性高、稳定性好等特点，可用于同时测定保健食品中左旋肉碱含量与纯度的分析，为手性药物开发、使用及相关法规的制定提供科学支撑。

技术领域

本发明保健食品的残留检测方法，尤其涉及一种保健食品中左旋肉碱和右旋肉碱对映体的残留量的测定方法。

背景技术

肉碱的化学名称为β-羟基-γ-三甲胺基丁酸,其分子中含有1个手性碳原子,具有L-型 (左旋)与D-型(右旋)对映异构体。其中左旋肉碱(L-Carnitine)，又称卡尼丁或L-肉碱，广泛存在于大多数哺乳动物组织中，能够促进脂肪酸向线粒体中传输，达到氧化分解脂肪的功效^[1]。左旋肉碱缺乏将干扰脂肪酸的代谢而导致能量合成不足，出现易疲劳、肌肉无力、心慌等症状，严重者出现代谢紊乱、昏迷甚至死亡。而D-型肉碱不但没有生理活性，甚至具有毒性，大剂量的情况下对人和动物都有害^[2]。目前，市售保健品中所用的左旋肉碱主要是采用生产成本低廉的化学合成法，生产出的肉碱一般是L-肉碱和D-肉碱的混合物，然后用分离的方法将D-肉碱从L-肉碱中分离出去，从而获得L-肉碱，该方法难以做到彻底分离D-肉碱^[3]。因此，迫切需要建立一种测定保健食品中L-肉碱的含量与纯度的分析方法。

目前L-肉碱的检测方法主要为分光光度法^[4-5]、高效液相色谱法(HPLC)^[6-7]、高效液相色谱-串联质谱法^[5,8-10]等，但对L-肉碱与D-肉碱对映异构体的拆分并进行含量测定的色谱条件方法报道较少。由于肉碱分子极性较大,色谱柱上很难保留，对映体分离度差，缺少发色基团，导致其在紫外可见光区吸收极弱,灵敏度低,难以在普通液相色谱中直接检测，故分离肉碱对映体须使用手性拆分技术。翟旭峰^[11]等采用L-丙氨酸-β-萘胺为衍生化试剂,成功对乙酰肉碱对映体进行拆分，但这些方法通常存在分离效率低、分析时间长、重现性低等问题。近年来超高效合相色谱(UPC²)受到了广泛关注。UPC²技术在传统液相色谱法的基础上，以超临界CO₂为主要流动相，它是一种介于气体和液体之间的超临界流体，黏度低，扩散率高，传质快，从而为其提供了比传统液相色谱更快的分离速度和更高的系统分辨率。研究表明，UPC²技术更适合于分析传统液相色谱难以处理的同分异构体和结构类似物，已成功用于多种化合物的分离检测，如维生素^[12]、邻苯二甲酸酯^[13]和紫外吸收剂^[14]等。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法，该方法通过前处理方法、衍生时间、衍生温度、仪器色谱条件等主要参数进行考察优化，建立了同时测定保健食品中左旋肉碱含量和纯度的方法，并对市售保健品和外消旋体肉碱标准品进行了分析测定。研究结果表明，本方法具有快速准确、分离效率高、重复性高、稳定性好等特点，能够满足保健食品中左旋肉碱的快速定量及纯度分析需要。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法，该方法包括以下的步骤：

一、样品提取