[发明专利]从表皮生长因子、凝集素和Tat蛋白衍生的支架蛋白

说明书

本发明涉及从表皮生长因子、凝集素和Tat蛋白衍生的重组支架蛋白。本发明设计的重组支架蛋白，具有衍生于人表皮生长因子的受体结合域、人纤维胶凝蛋白的胶原样结构域、人甘露糖结合凝集素糖基识别域与HIV‑1病毒的Tat蛋白的氨基酸重组序列。支架蛋白具有展示功能蛋白的能力，尤其适于例如在体外展示或相关的系统中构建文库，展示的功能蛋白具有糖蛋白结合活性、穿膜和核转位活性与靶标具有高亲和力和高特异性的特点，可以在生物、医药、环境、农业、食品诸多领域得到了广泛的应用和研究。本发明也涉及支架的各种用途，包括在治疗、诊断、环境和安全性监测、合成生物学和研究中的用途，和涉及表达支架蛋白的细胞和细胞培养物。

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域。更具体的说，本发明涉及从表皮生长因子、凝集素和Tat蛋白衍生的重组支架蛋白。

背景技术

几十年来，通过生物技术，获得了许多能与靶分子特异性结合的亲和功能蛋白，被广泛应用于生物、医药、环境、农业、食品等诸多领域。在这些亲和功能蛋白中，抗体就是典型代表。长期以来，抗体已被深入地应用于临床疾病治疗、诊断及基础研究中，成为人类战胜疾病的有效工具。然而，抗体作为大分子蛋白，存在天然的局限性，如超大的分子量，低组织渗透性，稳定性差，生产成本高，使用剂量大及潜在的免疫原性等。为了克服这些问题，人们可以设计或选择某些蛋白质作为支架蛋白(或称母核蛋白)，在保证支架蛋白主体结构不变的基础上，通过对其分子中8～30个氨基酸位点进行随机化突变，从而构建可供筛选的蛋白质组合文库，再通过噬菌体、酵母、细胞、核糖体、mRNA、cDNA或SNAP等展示技术，可以获得能与靶分子特异性结合的亲和功能蛋白。

现有支架蛋白如专利申请号为200780050902.4的源自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)衍生的支架蛋白Sac7d，又如专利申请号为201180021908.5的金黄色葡萄球菌A蛋白Z结构域衍生的支架蛋白、专利申请号为201180029216.5的III型纤连蛋白结构域“FN3”衍生的支架蛋白，再如专利申请号为201480022070.5的植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂衍生的支架蛋白以及胆汁三烯结合蛋白衍生的支架蛋白和锚蛋白重复序列衍生的支架蛋白等，已经展现出其巨大的潜在商业价值，并逐渐成为新的基础研究热点和技术创新点。

基于支架蛋白取得的亲和功能蛋白与抗体相比，具有以下优势：①分子量小，组织渗透性强，更快到达病灶部位；②分子稳定性好；③可以获得与靶标结合具有更高亲合力的结合物；④在辨别相关小分子之间微小差异方面，优于通过免疫获得的抗体；⑤作用靶点范围广；⑥低免疫源性；⑦可以采用工程化手段进行生产，成本低；⑧可以实现双靶点或多靶点特异性功能蛋白设计。

糖蛋白是含有寡糖链的蛋白质，由寡糖链与肽链中某些氨基酸残基以共价键连接而成。糖蛋白普遍存在于动物、植物及微生物中，种类繁多，功能广泛。糖蛋白主要有以下几种：①可溶性糖蛋白，包括存在于细胞内液、体液及腺体分泌的粘液中的酶、激素、抗体、补体、生长因子、干扰素、凝集素和毒素等蛋白质；②膜结合蛋白，包括酶、受体、凝集素及运载蛋白等。此类蛋白常参与细胞识别，可作为特定细胞或细胞在特定阶段的表面标志或表面抗原；③结构糖蛋白，包括如胶原及各种非胶原糖蛋白(纤粘连蛋白、层粘连蛋白等)，为细胞外基质中的不溶性大分子糖蛋白。它们的功能不仅仅是作为细胞外基质的结构成分起支持、连接及缓冲作用，更重要的是参与细胞的识别、粘着及迁移，并调控细胞的增殖及分化。