[发明专利]一种生物催化合成3-羟基-3-甲基丁酸的方法

说明书

本发明提供一种生物催化合成3‑羟基‑3‑甲基丁酸的方法，以亮氨酸为底物，由多酶或含有多酶的细胞催化合成，所述多酶由L‑氨基酸脱氨酶和4‑羟基苯丙酮酸双加氧酶组成。本发明在大肠杆菌中过表达L‑AAD和4‑HPPD从而构建一种应用于HMB生产全细胞催化系统，实现了以低成本亮氨酸为底物催化HMB的合成。本发明对获得的重组大肠杆菌进行高密度培养后，获得酶的最大表达，收集大肠杆菌菌体进行全细胞高效催化，反应结束后直接离心即可结束反应。该工艺有效地节约了生产HMB的成本，提高了催化体系的转换效率，操作简单，有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及生物催化合成3-羟基-3-甲基丁酸的方法。

背景技术

3-羟基-3-甲基丁酸(β-羟基-β-甲基丁酸，Beta-hydroxy-beta-methylbutyrate，HMB)是一种必需氨基酸亮氨酸的代谢产物，目前已广泛应用于动物饲料添加剂(JAnim.Sci,1994,72(9):2331–2337.)、人体运动营养剂(Nutr.Biochem.1997,8(6),300–311.)以及减肥食品中(Sports Med.2000,30,105–116.)，并且早在2002年有文献报道，HMB有望在治疗肿瘤等恶病中发挥良好的功效(Am J Surg,2002,183(4):471–479.)。2011年1月18日，卫生部批准β-羟基-β-甲基丁酸钙可作为新资源食品(批准翅果油和β-羟基-β-甲基丁酸钙为新资源食品的公告.食品与发酵工业,2011,37(1):93–93.)。

HMB传统的生产方法一般采用以次氯酸钠(液氯和氢氧化钠)、二丙酮醇、盐酸、乙酸乙酯、乙醇为主要原料，经氧化合成、酸化、萃取、中和等步骤进行化学合成，该方法在工业生产中得到了广泛的应用(Lima D A,Mccoy L W,Miller M E.US 1996.)。然而，有机合成过程中含有较多挥发性有毒有机物，反应步骤较为复杂。相比化学合成方法，生物合成法更环保，对人体的危害更小。早在1997年，Lee等人尝试以β-甲基丁酸(MBA)为底物，Galactomyces reessii为细胞工厂生产HMB，通过G.reessii将β-甲基丁酸转化为β-羟基β甲基丁酸。136h后HMB的最大浓度为38g/L，发酵过程中摩尔转化率大于0.50mol HMB/molof MBA(J Ferment.Bioeng.1996.81:79–82.)。2002年，Ye等在Lee工作的基础上优化了G.reessii培养条件。在最佳条件下，102h时HMB的产率达到29.0g/L，平均产率为0.098g/(L·h)，MBA摩尔转化率为57.3％，为当时报道的最高转换率和生产速率(华东理工大学学报,2002.28(6):601–605)。然而，微生物发酵法仍存在副反应、反应途径长、产物成分复杂、不易纯化等问题，使得最终产率和转化率较低。同时，底物MBA不仅价格昂贵，而且气味很难闻、挥发性强，易残留在环境中难以去除。因此，有必要开发一种经济、高效的HMB生产方法。

目前，酶和全细胞生物催化在绿色生物制造中更为常用，具有产率较高、底物特异性好以及易于纯化产物等优点。而与酶催化法相比，全细胞转化法具有屏蔽外界环境变化影响、提供辅酶再生体系、催化剂成本低等优点，并更有利于提高酶的稳定性和催化活性。因此，构建一个步骤短、副反应少、底物成本低的全细胞转化体系是本发明要实现的目标。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供一种以亮氨酸为底物经由α-酮异己酸生产HMB，底物亮氨酸价格低廉且反应过程均无有害物质的产生的生物催化合成3-羟基-3-甲基丁酸的方法。

本发明的第二个目的在于，提供一种合成3-羟基-3-甲基丁酸的重组大肠杆菌。

本发明的第三个目的在于，提供利用重组大肠杆菌合成3-羟基-3-甲基丁酸的方法。

为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种生物催化合成3-羟基-3-甲基丁酸的方法，以亮氨酸为底物，由多酶或含有多酶的细胞催化合成，所述多酶由L-氨基酸脱氨酶和4-羟基苯丙酮酸双加氧酶组成。