[发明专利]冷冻细胞聚集体的方法

说明书

提供了一种用于冷冻包括神经细胞的细胞聚集体的方法。提供了一种用于冷冻包括神经细胞并且具有三维结构的细胞聚集体的方法，所述方法包括以下步骤(1)和步骤(2)：步骤(1)用于在冷冻前在0℃至30℃的温度下在冷冻保存溶液中浸泡包括神经细胞的细胞聚集体，并且制备浸泡在所述冷冻保存溶液中的细胞聚集体；并且步骤(2)用于在具有至多‑150℃的温度的液氮容器的气相条件下冷冻包括神经细胞的所述细胞聚集体。

技术领域

本申请涉及一种用于冷冻包括神经细胞的细胞聚集体的方法。

背景技术

近年来，以细胞作为活性成分的药物的开发已经得以推广；例如，从多能干细胞(PSC)诱导产生多巴胺的神经元或其祖细胞并将其移植到患者的中脑中的细胞疗法被认为是一种很有前景的帕金森病治疗方法(非专利文献1至3)。对于基于细胞的药物，最终产品的冷冻保存是普及细胞疗法的必要要素(专利文献1至4)。与细胞生物学研究不同，冷冻保存的细胞在用于临床实践时，在解冻后不经恢复培养即可立即移植。因此，对于冷冻细胞重要的是在解冻后保持其植入能力、功能或活性以及细胞活力。

已经表明，实体组织的移植由于残留的供体血管和抗原呈递细胞而诱导比细胞悬液的移植诱导的更强的免疫应答(非专利文献4)。另一方面，如果通过同基因移植或免疫抑制剂来抑制免疫应答，就会消除这一问题，并且中脑腹侧(VM)组织的移植显示出比细胞悬液移植具有更高的存活率和行为恢复的产生多巴胺的神经(非专利文献5)。另外，获得细胞悬液的机械和酶解离过程可能改变细胞特性从而引起细胞损伤。因此，在临床应用中，希望将最终产品配制成球体而不是细胞悬液。然而，球体比单个细胞更难冷冻保存。

作为用于冷冻细胞的方法，已知缓冷法和玻璃化法(非专利文献6至8)。

缓冷法是一种将细胞与低浓度的冷冻保护剂(CPA)(诸如10％二甲基亚砜(DMSO))一起以约1℃/min冷冻的方法(专利文献5、非专利文献9和10)。在缓冷法中，冰的形成首先在细胞外间隙中开始，从而导致细胞外液浓缩。结果，由于跨细胞膜的渗透梯度，水被从细胞中抽出。细胞的这种脱水避免了细胞内冰的形成。然而，如果细胞过度脱水，它们会被浓缩的细胞内液和冷冻保存溶液中的CPA损伤。

另一方面，玻璃化法是一种超快冷却方法，其中在添加高浓度的冷冻保护剂(例如，DMSO、乙酰胺或乙二醇)后立即将细胞转移到液氮中并且立刻在非晶态下冷冻(专利文献6、非专利文献11)。换句话说，它是一种通过使细胞内外的溶剂在玻璃态下凝固来最大限度地减少冰晶生长的方法。玻璃化法需要严格的时间控制；与分散在溶剂中的单个细胞的情况不同，在细胞聚集体的情况下，冷冻保存溶液渗透到细胞聚集体中需要时间，因此可能无法充分获得对冷冻保存溶液的玻璃化效果。因此，将其应用于临床细胞生产在技术上是困难的(非专利文献12)。

如上所述，由于需要精确控制冰形成和细胞脱水，因此尚未建立球体的临床冷冻保存方法。

另外，虽然非专利文献13披露，通过使用可以在-190℃下储存的气相液氮储存容器将培养的细胞冷冻在气相中，可以防止支原体污染，但将细胞聚集体冷冻在液氮的气相中是完全未知的。

引用列表

专利文献

[专利文献1]JP2017-104061A

[专利文献2]WO 2017/159862

[专利文献3]JP2015-521469A

[专利文献4]JP2008-501320A

[专利文献5]JP2011-103885A

[专利文献6]JP2013-110988A

非专利文献

[非专利文献1]Doi等人,Stem Cell Reports,2(3),337-350,2014

[非专利文献2]Sundberg等人,Stem Cells 31,1548-1562,2013