[发明专利]工程化CasX系统

权利要求书

1.一种参考CasX蛋白的变体(CasX变体)，其中：

a.所述CasX变体包含所述参考CasX蛋白中的至少一个修饰；且

b.其中相比于所述参考CasX蛋白，所述CasX变体展现至少一种改良特征。

2.根据权利要求1所述的CasX变体，其中所述CasX变体的所述改良特征选自由以下组成的组：改良所述CasX变体的折叠；改良对引导核酸(gNA)的结合亲和力；改良对目标DNA的结合亲和力；改良在目标DNA的编辑中利用较大范围的一种或多种PAM序列，包括ATC、CTC、GTC或TTC的能力；改良目标DNA解旋；增加编辑活性；改良编辑效率；改良编辑特异性；增加核酸酶活性；增加用于双股裂解的目标股负载；减少用于单股切割的目标股负载；减少脱靶裂解；改良非目标DNA股的结合；改良蛋白质稳定性；改良蛋白质溶解度；改良蛋白质:gNA复合物(RNP)稳定性；改良蛋白质:gNA复合物溶解度；改良蛋白质产率；改良蛋白质表达；改良熔融特征，或其组合。

3.根据权利要求1或2所述的Cas X变体，其中所述至少一个修饰包含：

a.所述CasX变体的域中的至少一个氨基酸取代；

b.所述CasX变体的域中的至少一个氨基酸缺失；

c.所述CasX变体的域中的至少一个氨基酸插入；

d.来自不同CasX的域的全部或一部分的取代；

e.所述CasX变体的域的全部或一部分的缺失；或

f.(a)-(e)的任何组合。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的CasX变体，其中所述参考CasX蛋白包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的CasX变体，其中所述至少一个修饰在选自以下的域中：

a.非目标股结合(NTSB)域；

b.目标股负载(TSL)域；

c.螺旋形I域；

d.螺旋形II域；

e.寡核苷酸结合域(OBD)；或

f.RuvC DNA裂解域。

6.根据权利要求5所述的CasX变体，其包含所述NTSB域中的至少一个修饰。

7.根据权利要求5所述的CasX变体，其包含所述TSL域中的至少一个修饰。

8.根据权利要求7所述的CasX变体，其中所述TSL域中的所述至少一个修饰包含SEQ IDNO:2的氨基酸Y857、S890或S932中的一个或多个的氨基酸取代。

9.根据权利要求5所述的CasX变体，其包含所述螺旋形I域中的至少一个修饰。

10.根据权利要求9所述的CasX变体，其中所述螺旋形I域中的所述至少一个修饰包含SEQ ID NO:2的氨基酸S219、L249、E259、Q252、E292、L307或D318中的一个或多个的氨基酸取代。

11.根据权利要求5至10中任一项所述的CasX变体，其包含所述螺旋形II域中的至少一个修饰。

12.根据权利要求11所述的CasX变体，其中所述螺旋形II域中的所述至少一个修饰包含SEQ ID NO:2的氨基酸D361、L379、E385、E386、D387、F399、L404、R458、C477或D489中的一个或多个的氨基酸取代。

13.根据权利要求5所述的CasX变体，其包含所述OBD域中的至少一个修饰。

14.根据权利要求13所述的CasX变体，其中所述OBD中的所述至少一个修饰包含SEQ IDNO:2的氨基酸F536、E552、T620或I658中的一个或多个的氨基酸取代。