[发明专利]改善DMB标记的唾液酸的荧光信号的方法和试剂盒

说明书

本发明提供了改善来自用染料1,2‑二氨基‑4,5‑亚甲二氧基苯(“DMB”)标记的唾液酸的信号的方法和试剂盒。所述方法包括将所述唾液酸用在水溶液中的DMB标记，所述水溶液包含pH通过酸诸如磷酸或盐酸调节至1.5‑3.2的甘氨酸氨基酸和还原剂。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年6月14日提交的美国临时专利申请号62/861,924的权益和优先权，其内容出于所有目的通过引用并入本文。

联邦资助声明

不适用。

背景技术

本发明涉及改善来自用染料1,2-二氨基-4,5-亚甲氧基苯(“DMB”)标记的唾液酸(诸如从糖缀合物或参考标准品释放的那些)的信号的领域。

多个商业和法规要求使得需要确定糖蛋白或糖肽上存在的聚糖的性质和量，并且特别是对于用作治疗剂的糖蛋白。由于附着至糖蛋白的聚糖可以影响对于糖蛋白的功能至关重要的特征，包括其药代动力学、稳定性、生物活性和免疫原性，重要的是确定存在哪些聚糖。食品药品监督管理局(Food and Drug Administration)要求进行附接至生物制品(诸如治疗性糖蛋白和疫苗)的聚糖的表征，以显示物质的组成和制造的一致性，从而导致需要对产品进行广泛表征。对于治疗性和非治疗性重组蛋白二者的生产中的质量控制，对碳水化合物谱的分析也是重要的，其中碳水化合物谱的变化可以指示系统中的应激，从而表明可能需要丢弃商业规模发酵罐的内容物的状况。因此，生物化学家、临床化学家、制药商和蛋白质生产商对确定生物学样品(诸如治疗性糖蛋白)中聚糖的分布谱非常感兴趣。

唾液酸是在与糖蛋白相关的许多聚糖上发现的9碳羧化2-酮糖家族。如Reiding等人,Analyt.Chem.,2014,86:5784-93,“N-glycans on mammalian proteins oftenexhibit terminal sialic acids such as N-acetylneuraminic acid,which...showsimportance in cellular communication,and determines protein half-life.Sialicacids are most frequently attached to a terminal galactose viaα2,6orα2,3glycosidic linkages and show different functionality as a consequence.”Reiding等人,第5784页所指出。自然界中已鉴定出超过25种唾液酸衍生物，并且已显示其在多种生物活性中发挥作用。

可以通过以下方式进行与糖蛋白或其他糖缀合物附接的唾液酸的存在和类型的确定：通过用唾液酸酶进行唾液酸的酶消化或通过将糖蛋白或其他糖缀合物在80℃下在酸溶液诸如2M乙酸或0.05N HCl中孵育1至3小时进行部分酸水解来释放唾液酸。一旦唾液酸从它们所附接的任何糖缀合物中被释放出来，就可以将其用DMB标记并且然后通过各种分析技术进行检测。典型地，将唾液酸在包含大约1.5M乙酸和至少一种还原剂(典型地是β-巯基乙醇)的溶液中用DMB标记，通过液相色谱法分离所得的DMB标记的唾液酸，以及将分离的标记的唾液酸提供给荧光检测器，然后对来自标记的唾液酸的信号进行定量。

不幸的是，乙酸可能是唾液酸的酸水解和随后唾液酸的DMB标记中最常用的酸，具有强烈的气味和挥发性。如果不保持被盖紧，则酸的体积会减少，从而无法计算浓度。此外，DMB标记方案中常用的还原剂β-巯基乙醇不仅具有强烈的令人不快的气味，而且还是一种毒素，其如果被吸入、吞咽或通过使用者的皮肤吸收，则可能会致命。而且，虽然DMB标记被认为是用于检测样品中存在的唾液酸的灵敏且选择性的技术，但一些唾液酸仅以少量存在于一些糖缀合物上，并且一些糖缀合物非常昂贵或难以生产，以至于减少测量其唾液酸化所需的糖缀合物的量将是有用的。增加来自DMB标记的唾液酸的信号将有助于增加检测样品中唾液酸的能力，即使仅存在少量。