[发明专利]一种使用cDNA展示的新型免疫PCR方法

说明书

本发明提供了一种通过使用cDNA展示的改进的免疫PCR方法，该方法包括以下步骤：将具有结合位点的第一抗体固定到固相上；将样品液与所述抗体接触以结合所述样品液中的靶分子；将所述靶分子与由以下组成的cDNA展示接触：由双链组成的主链，和具有结合第二抗体的第二抗原结合位点的侧链；并进行聚合酶链反应以定量检测所述cDNA。根据本发明的改进的免疫‑PCR方法，靶分子被筛选和定量获得，因为它使用由一种蛋白质/肽和一种DNA组成的cDNA展示。

技术领域

本发明涉及一种新型免疫-PCR方法。具体而言，它涉及使用cDNA展示的新型免疫PCR方法。

背景技术

以低浓度存在于生物样品(例如，血清、尿液等)中的生物标志物的检测在基础生物学和诊断中至关重要。由Sano等首先开发的免疫-PCR(它被称为“IPCR”)[参见非专利文献1，现有技术1]，是用于此目的的灵敏且定量的分析技术[参见非专利文献2]。

一般IPCR方法包括用包被在表面上的捕获抗体初始捕获靶标抗原，随后用连接有DNA报告基因的检测抗体进行检测。该DNA用合适的引物通过PCR扩增，并使用实时PCR装置进行荧光定量。由于该方法结合了免疫分析和PCR的优点，它兼具高通用性和指数信号放大。近年来，IPCR已被应用于检测各种抗原，包括癌症生物标志物和病毒。

在IPCR的开发和应用中，抗体如何与报告基因DNA结合是一个关键问题。传统上，链霉亲和素已被用作结合生物素化DNA和生物素化抗体的接头(图1A)。在图1A中，链霉亲和素用于将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA报告基因连接起来。然而，链霉亲和素的四聚体性质导致异质DNA-抗体缀合物的形成，这可能会降低IPCR的重现性。

另一种方法依赖于将DNA直接缀合到抗体上的化学交联剂(图1B)。在图1B中，使用了共价交联的抗体-DNA缀合物。虽然这可以降低复杂性并且很简单，但常规交联化学会与抗体中的所有半胱氨酸/赖氨酸残基发生反应，并且修饰可能会损害抗体的结合亲和力。此外，与一种抗体结合的DNA分子的数量是异质的并且难以控制。为了解决这些问题，Zhang等开发了一项创新技术：噬菌体展示介导的免疫PCR(PD-IPCR，图1C)。在图1C中，包括抗体的单链可变片段和VHH的不同的肽可以展示在M13或T7噬菌体的表面上。噬菌体DNA用作DNA标记物。

噬菌体展示于1985年由Smith首次描述[参见非专利文件3]，并广泛用于包括抗体在内的多肽的定向进化。在PD-IPCR中，一种表达病毒表面分析物的单链抗体的工程化的噬菌体M13(或T7)用作抗体和DNA的超分子复合物。噬菌体与经固定抗原温育后，细菌DNA被扩增以进行定量。在IPCR中使用噬菌体颗粒避免了抗体-DNA缀合物的繁琐制备，并提供了低成本和高灵敏度的蛋白质、毒素和病毒的检测[参见专利文件4和5]。

引用列表

非专利文件

NPL 1：T.Sano等，Science，258(1992)120-122.

NPL 2：L.Chang等，Anal.Chim.Acta.，910(2016)12-24.

NPL 3：G.P.Smith，Filamentous fusion phage：novel expression vectorsthat display cloned antigens on the virion surface，Science，228(1985)1315–1317.

NPL 4：R.Monjezi等，J.Virol.Methods，187(2013)121-126.

NPL 5：J.Lei等，Anal.Chem.，86(2014)10841-10846.

发明内容

技术问题