[发明专利]用于生产AAV颗粒的方法和系统

权利要求书

1.一种生产重组腺相关病毒(rAAV)的方法，所述方法包括：

(a)将至少一个病毒生产细胞(VPC)引入生物反应器中并且在所述生物反应器中扩增VPC数量至目标VPC细胞密度；

(b)将至少一个包含AAV病毒表达构建体的表达杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)和至少一个包含AAV有效负载构建体的有效负载BIIC引入所述生物反应器中；

(c)在导致在一个或多个所述VPC内生产一个或多个rAAV的条件下，在所述生物反应器中温育VPC、表达BIIC和有效负载BIIC的混合物；

(d)从所述生物反应器收获病毒生产池，其中所述病毒生产池包含液体培养基和含有所述一个或多个rAAV的所述一个或多个VPC；

(e)在化学溶胞条件下使用化学溶胞溶液使所述病毒生产池内的所述一个或多个VPC暴露于化学性溶胞，其中所述化学性溶胞将来自所述VPC的所述一个或多个rAAV释放到所述病毒生产池的所述液体培养基中；

(f)通过一个或多个澄清过滤步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池通过一个或多个澄清过滤系统处理；

(g)通过一个或多个亲和色谱步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池通过一个或多个亲和色谱系统处理；

(h)通过一个或多个离子交换色谱步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池通过一个或多个离子交换色谱系统处理；

(i)通过一个或多个切向流过滤(TFF)步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池通过一个或多个切向流过滤(TFF)系统处理；以及

(j)通过一个或多个病毒截留性过滤(VRF)步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池通过一个或多个病毒截留性过滤(VRF)系统处理。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述VPC包含Sf9昆虫细胞，并且其中使用杆状病毒生产系统生产所述rAAV。

3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述生物反应器的体积为至少5L、10L、20L、50L、100L或200L。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在BIIC引入时，所述目标VPC细胞密度为2.0-4.0×10⁶个细胞/毫升、2.5-3.5×10⁶个细胞/毫升、或约3.0×10⁶个细胞/毫升。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中BIIC引入时的VPC细胞相对于引入所述生物反应器中的表达BIIC数目的比率为1:2.0×10⁵至1:4.0×10⁵v/v之间、1:2.5×10⁵至1:3.5×10⁵v/v之间、约1:2.5×10⁵v/v、约1:3.0×10⁵v/v、约1:3.5×10⁵v/v或约1:4.0×10⁵v/v。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中BIIC引入时的VPC细胞相对于引入所述生物反应器中的有效负载BIIC数目的比率为1:5.0×10⁴至2.0×10⁵v/v之间、1:8.0×10⁴至1:1.5×10⁵v/v之间、约1:8.0×10⁴v/v、约1:1.0×10⁵v/v或约1:1.5×10⁵v/v。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中引入所述生物反应器中的表达BIIC相对于引入所述生物反应器中的有效负载BIIC的比率为1:1至5:1之间、2:1至4:1之间、2.5:1至3.5:1之间、或约3:1。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述一个或多个澄清过滤步骤包括通过深层过滤系统、0.2μm微滤系统或其组合处理所述病毒生产池。