[发明专利]一种玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法

说明书

本发明公开了一种玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，包括以下步骤；步骤一：选取外植体材料，在幼苗茎节上划上伤口，步骤二：将处理完成后的幼苗茎节放置在培养皿中静置，幼苗茎节伤口处出现愈伤组织，步骤三：将其放置在培养基中，培养基底层垫一层试纸，将携带有目的基因载体的农杆菌置入其中，与幼苗茎节共培养，步骤四：进行筛选，步骤五：将幼苗茎节从筛选培养基取出，置于培养基中培养，分化出芽；玉米胚胎采用农杆菌介导方式遗传转化，通过幼苗茎节上划出创口并与带有农杆菌成分的试纸相接，以解决传统农杆菌介导方式不易渗入茎叶细胞内的缺点，加快反应速率，提高玉米成熟种子幼苗茎节的转化效果。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法。

背景技术

玉米既是重要的饲料和粮食作物，也是极其重要的工业原料作物。目前全球玉米产量稳步增长，但随着经济的快速发展和人民生活水平的迅速提高，玉米消费总量则持续增加，供求矛盾加剧。通过常规育种进行玉米的遗传改良是现在玉米增产的主要途径之一，但有限的遗传资源和比较长的育种周期等因素往往限制了其应用的潜力。在对玉米种子遗传转化中往往采用农杆菌介导方式进行转化，其步骤是将农杆菌培养至适当浓度，受体材料消毒处理并切成适当大小组织块，然后将组织块浸泡于菌液中适当的时间，将浸泡过的组织块放于共培养基上培养，最后使组织块转移到筛选培养基上培养,选出阳性幼苗。

现有的农杆菌介导方式在对幼苗茎节进行转化时，转化效率不高，由于茎节结构组成较为封闭，农杆菌很难渗入幼苗茎节进行分化，从而在培育过程中需要花费大量时间，需要进行改善。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，包括以下步骤；

步骤一：选取外植体材料，玉米成熟种子幼苗茎节，将其置于70％浓度乙醚中，清洗2-3遍，然后在无菌环境下，通过器械在幼苗茎节上划上与茎节纹理垂直的伤口；

步骤二：将处理完成后的幼苗茎节放置在培养皿中，保持环境温度在20-28℃，在黑暗环境下静置2-3天，幼苗茎节伤口处出现愈伤组织；

步骤三：对幼苗茎节进行挑选，观察表面是否出现破损，茎节培养是否正常，将其放置在培养基中，培养基底层垫一层试纸，将携带有目的基因载体的农杆菌置入其中，与幼苗茎节共培养3-5天；

步骤四：将幼苗茎节取出置入筛选培养基中，筛选12d，重复筛选5-8次；

步骤五：将幼苗茎节从筛选培养基取出，置于培养基中并在室温昏暗环境下培养10-12天，有新芽萌动后，转到基础培养基中，在室温和12h光照条件下，分化出芽。

优选的，所述步骤一中幼苗茎节上伤口大小控制在1-3mm。

优选的，所述步骤三中幼苗茎节伤口处紧挨试纸放置。

优选的，所述步骤四中筛选培养基包括终浓度为3-5mg/L的草丁膦和终浓度为160-175mg/L的特美汀。

优选的，所述所述步骤三中培养基成分包括MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.2g/L脯氨酸+0.6g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L 2,4-D，琼脂6.5g/L。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：玉米胚胎采用农杆菌介导方式遗传转化，通过幼苗茎节上划出创口并与带有农杆菌成分的试纸相接，以解决传统农杆菌介导方式不易渗入茎叶细胞内的缺点，加快反应速率，提高玉米成熟种子幼苗茎节的转化效果。

具体实施方式