[发明专利]超多重引物设计方法

说明书

本发明涉及核酸检测技术领域，具体而言，涉及一种超多重引物设计方法。所述方法包括：获取待检测的目标序列并设计引物，建立引物池；以待扩增目标区域分别进行横向及纵向排列，将所述引物池中各待扩增目标区域的引物标记在待扩增目标区域以建立二元矩阵，对矩阵内的单条引物的分值进行评价，将低于预期的引物进行替换，对合格的引物组合进行输出。该方法可根据预期需要检测的病原微生物选择特异性区域并设定罚分机制进行特异性引物设计，自建二元矩阵评分机制对引物序列特异性进行分析，减少实验摸索测试，可以高效快速地同时扩增多个基因。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体而言，涉及一种超多重引物设计方法。

背景技术

多重PCR是PCR发展过程中衍生出的PCR为基础的扩增技术，可在一个反应体系中通过一对以上的引物，分别扩增不同模板而获得不同的扩增片段，既保留了常规PCR的特异性和敏感性，又减少了操作步骤及试剂用量的使用，降低因操作而导致的污染。随着高通量测序技术的发展，对PCR产物进行高灵敏度及高分辨率的检测成为了可能，多重PCR的限制由可同步扩增的片段数量上限变为多重PCR自身体系的限制，从而在NGS领域，衍生出超多重PCR技术。

超多重PCR的原理与多重PCR相似，但不同于传统的4-5重的多重PCR，辅以高通量测序能将PCR提升至上千重甚至上万重。基于超多重PCR的靶向NGS(tNGS)相较于普通宏基因组具有更高的灵敏度，更低的检测成本优势，该技术未来将在遗传病检测、癌症检测及病原微生物检测中有巨大的应用空间。基于超多重PCR的病原微生物tNGS是一种灵敏度高、特异性强的检测方法，具有无可比拟的优越性。tNGS不仅能针对病原微生物的科、属特异性、种特异性及种下分类进行鉴定，将病原微生物精确到不同的基因型，同时还能针对性地了解其毒力基因及耐药基因，为患者的诊疗提供参考。

然而，超多重PCR的设计需要综合考虑模板、引物及反应体系等诸多因素，目前依旧存在诸多难题。其中，引物设计是超多重PCR效果优劣的决定性因素。

超多重PCR设计的引物应具有极高的抗干扰性，使得引物间不会互补，尤其是引物3’端的互补。

引物扩增的目标区域应具有特异性，应保证引物不能扩增目标区域以外的区域。

超多重引物的长度研究应同时考虑自身二级结构及引物特异性等因素，引物越长，越容易形成引物二聚体。但为了保证引物扩增的特异性，常会设计更长的引物以结合特定模板。

发明内容

本发明的方法建立了一种超多重PCR引物设计方法。具体来说，即针对不同靶序列，设计多对特异性引物，用于基于超多重PCR。超多重引物设计装置系统能够设计上千甚至上万对引物并提供有效的引物组合方案，相对传统多重PCR，提高PCR的效率，缩短实验周期。

本发明的第一方面涉及一种超多重PCR引物设计方法，包括：

获取待检测的目标序列并设计引物，建立引物池；

以待扩增目标区域分别进行横向及纵向排列，将所述引物池中各待扩增目标区域的引物标记在待扩增目标区域以建立二元矩阵，对矩阵内的单条引物的分值进行评价，将低于预期的引物进行替换，对合格的引物组合进行输出；

其中，所述单条引物分值的评价方法包括a)和b)：

a)通过如下罚分机制机进行评价，将所得分值低于阈值的引物进行替换：

a₁)每条引物自身头尾存在连续2个以下碱基互补配对的情况，+2分；

引物自身头尾存在连续2-3个碱基互补配对的情况，+1分；

引物自身头尾存在连续3个以上碱基互补配对的情况，+0分；

a₂)引物Tm值与Tm平均值的偏移程度在2℃以内的，每条引物+1分；