[发明专利]新型视网膜静脉阻塞小鼠模型的构建方法

说明书

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及新型视网膜静脉阻塞小鼠模型的构建方法。该新型视网膜静脉阻塞小鼠模型的构建方法包括采用光动力方法干预小鼠后行玻璃体内给予Muller细胞代谢抑制剂注射的步骤。采用该构建方法制得的视网膜静脉阻塞小鼠模型稳定、可实现持久的视网膜水肿，便于验证药物靶点及候选药物注射后作用机制，为视网膜静脉阻塞疾病研究提供了新一代的动物模型工具。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种新型视网膜静脉阻塞小鼠模型的构建方法。

背景技术

视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion,RVO)是眼科临床中常见的视网膜血管性疾病之一，其发病率仅次于糖尿病视网膜病变，在全世界范围内大约有 1430万的成年人受到影响。RVO按照阻塞部位可分为分支视网膜静脉阻塞(Branch retinal veinocclusion,BRVO)、中央视网膜静脉阻塞(Central retinal vein occlusion,CRVO)和半侧视网膜静脉阻塞(hemi-central retinal vein occlusion， HCRVO)。RVO通常由血栓形成引起，随着病程进展可能导致继发于RVO的黄斑水肿(macular edema，ME)和新生血管青光眼等并发症，使视力严重下降受损甚至失明。目前，继发于RVO的ME治疗方法包括黄斑格栅激光光凝术、长效类激素药物眼内注射以及抗血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor， VEGF)药物眼内注射等。其中，由于眼内注射抗VEGF治疗RVO对患者视力提高有较好的疗效，并且副作用小而广泛被临床医生和患者所接受。国内一线用于继发于RVO的ME(黄斑水肿)的anti-VEGF药物包括康柏西普及雷珠单抗 (lucentis)，二者均通过特异性地拮抗VEGF进而发挥治疗ME进展的作用。而既往的实验研究表明雷珠单抗主要识别人源VEGF，而对小鼠VEGF识别效率较低。因此，康博西普更加适合用于新型RVO小鼠模型验证。

目前用于RVO模型构建的动物包括啮齿类(小鼠及大鼠)、猫、狗、猪及非人类灵长类动物，而它们均具有各自的优缺点。小型动物眼球相对小，但饲养方便，费用相对低廉，而大型动物眼球较大，但费用高、饲养及操作困难，而除了人类灵长类动物之外的模式动物均不具备黄斑结构，因而只能通过诱导视网膜水肿进而模拟ME。考虑到经济成本、操作可行性及伦理问题，小鼠是最常用于RVO模型构建的动物。用于RVO构建的方法包括血管结扎法、玻璃体腔内注入内皮素-1法、激光光凝封闭视网膜静脉法及光动力法。通过上述方法制作的实验性RVO动物模型，经过眼底照相、FFA和组织学检查均证实RVO造模24h 后视网膜有出血、水肿、血流瘀滞、微血管扩张渗漏等一系列典型RVO表现和病理特征，但每种方法都存在各自的优缺点，尤其在制作方法的可操作性、对实验动物的创伤性和阻塞血管的再通时间等方面。血管结扎法需切开眶外侧壁，手术创伤较大，术后动物感染机会增加，存活率明显下降，严重影响实验结果的长期观察。而玻璃体腔内注入内皮素-1法诱导RVO是由于血管严重痉挛造成的，与人RVO形成机制相差较大，仅适合进行视网膜缺血后电生理改变的研究，不宜用作实验治疗模型。激光光凝封闭视网膜静脉法阻塞的血管阻塞血管3天再通，需多次重复光凝，会造成对视网膜色素上皮、感光细胞及视网膜内层组织严重的热损伤。更重要的是，激光光凝法是通过激光将血液凝固，而不是形成血栓，与临床上的RVO形成机制有所不同。光动力法是将光敏药物注入静脉后，激光照射预阻断的视网膜血管，在光敏药物与照射激光的共同作用下形成RVO模型。相对其他造模方法，光动力法具有无创操作及避免视网膜组织过度损伤的优势，然而阻塞血管往往在造模后1周左右再通。综合目前RVO动物模型现状，通过光动力法构建的小鼠RVO模型是最为适合的方案，这也在诸多临床前药物的功能验证中得到应用。目前用于RVO动物模型构建的的光敏剂包括孟加拉红及赤藻红B，其中孟加拉红更为常见。然而，进一步分析发现，造模后第7天的anti-VEGF组及对照组的小鼠视网膜厚度均低于造模干预前，导致这一现象可能的原因包括阻塞的血管在一周时再通，缓解了局部水肿情况，同时，造模导致的缺血缺氧刺激导致细胞凋亡增加，细胞含量减少，进而导致视网膜厚度下降。造模后RVO小鼠视网膜厚度在1周后低于基线水平，而待验证药物靶点及候选药物往往在玻璃体内注药后1周才能发挥作用，这给相关的研究造成困扰，因而我们需要更持久的视网膜水肿模型。