[发明专利]肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片及其制作与检测方法

说明书

提供一种肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片，包括相互贴合的玻璃基片(1)与PDMS片(2)，PDMS片(2)开设第一通孔(3)、第二通孔(4)、第三通孔(5)、凹坑(6)、初始流槽(7)、第一流槽(8)、第二流槽(9)依次连接；凹坑(6)形成TEX捕获检测区，第三通孔(5)形成microRNA捕获检测区；玻璃基片(1)的对应区域分别溅射有用于将TEX与microRNA捕获检测的三电极体系；第一流道段、第二流道段上面设置可使此流道段关闭的第一阀门与第二阀门；将肿瘤细胞外泌体与其核酸检测功能集成于一体；本发明还提供此种芯片的制作方法与检测方法。

相关申请的引用结合：

本案申请人2020-07-06申请的ZL 202010639672.2，名称为“一种单细胞温度检测传感器及其制作方法与检测方法”的专利申请通过引用的方式结合，如同全部提出。

技术领域：

本发明涉及细胞检测技术领域，具体涉及一种肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片及其制作与检测方法。

背景技术：

早期发现是控制癌症疾病的关键。我国的癌症治疗能力并不低，一些大型医院的设备和诊治水平已经接近发达国家，但对癌症防控的能力非常低。

液体活检成为了肿瘤诊断和预后监测较为理想的选择，血液中癌症标志物——外泌体是一类在细胞生长过程中释放出来的具有双分子层结构的微囊泡，一般直径在30～150nm之间。相比于正常细胞，肿瘤细胞由于所处的低氧环境刺激，会产生更多的外泌体。外泌体作为细胞间输送物质的媒介，参与调节多种生理病理反应。而肿瘤外泌体参与肿瘤的发生、血管生成等过程。此外，肿瘤外泌体(Tumor-derived exosomes,TEX)还可以释放相关信号分子，阻止免疫系统的肿瘤识别和抗肿瘤过程等。与循环肿瘤细胞相比，外泌体也携带有肿瘤细胞遗传特征分子，而且数量更多。因此在临床上，TEX可以作为一种稳定和敏感的肿瘤标志物，对其进行高灵敏检测可以用于癌症早期诊断、疗效实时监控和预后跟踪。

核酸是生物的遗传物质，包括了核糖核酸(RNA)，而microRNA被称为微小核糖核酸，microRNA参与人体的生理活动并在其中起到重要的作用。MicroRNA，也称miRNA，是一种短序列的非编码RNA，与多种癌症的形成和发展密切相关。miRNA在转录后水平调节肿瘤相关基因表达，发挥抑癌或者促癌功能。miRNA可以以外泌体内容物的形式稳定存在于血液中，受到外泌体双层膜结构的保护而免受酶类物质的降解作用。相比于血液中的游离miRNA，外泌体可以提供富集的和稳定的miRNA，所反映的基因信息也更加准确和可靠。肿瘤细胞来源外泌体miRNAs通过识别靶mRNA，指导、沉默、复合体降解mRNA，或者阻止mRNA翻译参与各种调节。研究表明，在相比于血清中microRNA总量，定量检测TEX中microRNA可以有效提高肿瘤检测的准确性，肿瘤外泌体microRNA是一种有价值的标志物。

想对TEX-miRNA进行准确检测，就要先得到高纯度的外泌体样本。目前存在的常规外泌体分离方法有超速离心法、超滤法、沉淀法和免疫磁珠法等。超速离心法处理时间长、昂贵的仪器设备和技术要求高，外泌体得率和纯度不高，如：专利文献CN211620485U。沉淀法可以快速简便的分离外泌体，但同样存在这费用高、波动性大，中等的得率和纯度，如专利文献：CN111117949A。免疫磁珠法是利用外泌体膜表面过量表达的抗原(CD63、CD9等)与磁珠标记抗体的相互作用，外泌体纯度高、得率较低，如：专利文献CN111575228A。总之，这些传统方法在一定程度上可以获得富集的外泌体样本，但是存在外泌体纯度不高、得率低，时间费用成本较大等问题。

目前公开的肿瘤外泌体microRNA分离技术和检测技术主要存在以下几点问题：1)检测步骤繁琐，成本高。2)无法对肿瘤细胞来源外泌体miRNA进行特异性检测。3)灵敏度低、可靠性低。

发明内容：