[发明专利]磷脂酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体，杂交瘤细胞株和应用

说明书

本发明公开了一株由全基因合成的方法获得GPC3全长蛋白抗原免疫产生，可特异性地与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)结合的单克隆抗体，产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株和应用。本发明公开的单克隆抗体特异性高，灵敏度高，可检测到微量表达的GPC3蛋白，可以作为肝癌患者临床早期诊断的参考指标，可大量应用于临床检测和治疗。

技术领域：

本发明属于杂交瘤细胞株领域，具体地说涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3(GPC3)单克隆抗体，杂交瘤细胞株制备和单克隆抗体的应用。

背景技术：

原发性肝癌(HCC)是全球常见恶性肿瘤之一，全世界每年超过78万人死于 HCC，每年新发病例84万，我国HCC的发病率和病死率占全球的55％以上，且呈逐年上升趋势。对于早期的HCC患者，主要采用早期肝切除术，这是目前 HCC治疗最有效的根治性手段。然而HCC起病隐匿，进展较快，很多患者在发现肿瘤时已经处于中晚期，丧失手术切除机会，而放射治疗、局部消融治疗、肝动脉化疗栓塞等治疗方法疗效有限，因此早期诊断和早期治疗是提高HCC患者生存率的关键。甲胎蛋白(AFP)是目前临床常用的肝癌特异性肿瘤标记物，然而，由于其灵敏度(39-64％)与特异性(76-91％)均有限，在部分慢性肝病和肝硬化患者，血清AFP水平也会升高，肝损伤和肝脏再生也能够增加非HCC患者血清AFP水平；近年来，异常凝血酶原(DCP，也称PIVKA-II)已被国内外指南列为肝癌检测极其重要的指标，但其特异性和敏感性仍然不足，而且在慢性肝炎和维生素K缺乏症也会轻度升高。因此寻找新的肝癌特异性标记物显得尤为重要。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是硫酸乙酰肝素糖蛋白家族的一员，GPC3基因位于人类X染色体的26位，编码了580个氨基酸，分子量为66kD。研究显示，GPC3主要在滋养层和多种胚胎组织表达，在成人组织几乎不表达，当组织发生恶性转化时，GPC3 mRNA和蛋白就会再次表达，尤其在肝癌组织中高表达，因此被看作新的肝癌标记物，可以作为HCC临床早期诊断的参考指标。目前，还有研究发现，GPC3可能成为新的HCC免疫治疗靶点，能够对肿瘤靶细胞进行特异性杀伤。

目前，市场销售的GPC3抗体多数为进口产品，价格昂贵，更重要的是的特异性和敏感性较低，限制了其在临床诊断方面以及靶向治疗方面的应用。目前市场销售的GPC3抗体价格昂贵且在实验中用量大，如Abcam公司的重组GPC3抗体 (货号ab207080)，免疫荧光检测使用浓度为1.136ug/ml，Western blot检测使用浓度为0.568ug/ml,100ul价格高达4853元。正因为如些，难以大规模应用。

中国专利201210086014.0与201210086009.X公布了GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6与7D11及其制备方法和应用，其中进行免疫荧光实验抗体需进行 1:10稀释，说明抗体用量大灵敏度不足。中国专利201510097025.2是用GPC3 人工半抗原作为免疫原制备GPC3单克隆抗体的，中国专利201110033378.8是用 GPC3-C端蛋白作为免疫原制备GPC3单克隆抗体的，中国专利201410767938.6 是用GPC3蛋白片段作为免疫原制备GPC3单克隆抗体的。上述专利的GPC3选取抗原不同，敏感性参差不齐，灵敏度差，重复性差。

发明技术内容：

本发明的一个目的是提供高度灵敏性的单克隆抗体，该抗体由采用密码子优化及全基因合成的方法获得GPC3全长蛋白抗原免疫产生，可特异性地与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)结合。

本发明的另一个目的是提供产生的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株可分泌抗GPC3蛋白的单克隆抗体，此抗体高度灵敏，重复性好。

本发明的第三个目的是制备分泌GPC3抗体的杂交瘤细胞株的方法。

本发明的第四个目的是制备抗GPC3的单克隆抗体的方法。

本发明的再一个目的是抗GPC3的单克隆抗体的应用。