[发明专利]高产PHA的卡巴耶罗氏菌株、筛选方法及其产生PHA的方法

说明书

本发明提供了高产PHA的卡巴耶罗氏菌株、筛选方法及其产生PHA的方法，所述菌株保藏名称为Caballeroniasp.Y5702，保藏单位广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No.61153，保藏日期为2020年8月14日。保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。PHA积累量已经达到菌体干重88%‑95%，较高的占比为发酵后的提取工作节约了大量的资源，是一株可运用于工业发酵生产PHA的优秀菌株。

技术领域

本发明涉及一种高产PHA菌株，具体地说是涉及一种高产PHA的卡巴耶罗氏菌株(Caballeronia sp.Y5702)、筛选方法及其产生PHA的方法。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是生物体中常见物质，参与各种生命活动的同时也作为微生物的碳源储存物质累积在细胞中。作为新型材料其良好的热加工性、优秀的生物相容性与可降解性，使其在尖端医学、食品领域等有着巨大的应用前景。

近些年，我国工业发酵PHA存在菌株产量不理想、PHA积累量占比过低、重组菌株不稳定等诸多问题。现有技术中通常采用下述方式筛选PHA菌株：将10mg尼罗蓝染色剂溶于0.5ml丙酮中，去离子水稀释至20ml，制备得到0.5mg/ml的尼罗蓝染色溶液母液；继续稀释得到0.2mg/L的尼罗蓝染色剂工作液，挑取发酵完成后的菌液，涂布于载玻片上火焰固定，冷却后滴加尼罗蓝染色剂工作液，置入烘箱50℃烘干；待烘干后利用8％冰醋酸溶液脱色1min，水洗后添加盖玻片置于荧光显微镜下观察荧光。该方法操作相对繁琐，且存在较大误差，不适用于大规模筛选。

同时，现有的培养基不能发挥菌株的PHA积累潜能。刘俊梅、王庆等人的团队于2016年发表于微生物学通报的文章《紫外线和硫酸二乙酯复合诱变选育PHB高产菌株》中通过诱变筛选得到的菌株PHB产量达到15.94g/L，占细胞干重69.54％。尹进等人2016年发表于《生物工程学报》的文章《聚羟基脂肪酸酯的研究进展》中提及目前野生型菌株的PHA产量仅有5.72g/L，通过串联启动子构建工程菌株，才能使得其PHA累积量达到90％。

因此，提供高产PHA菌株及利用其高效制备PHA是目前需要解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种高产PHA的卡巴耶罗氏菌株(Caballeroniasp.Y5702)，以解决现有发酵生产PHA的菌株产量不理想、PHA积累量占比过低、重组菌株不稳定等问题。

本发明的目的之二是提供前述高产PHA的卡巴耶罗氏菌株(Caballeroniasp.Y5702)产生PHA的方法。

本发明的目的之三是提供高产PHA的卡巴耶罗氏菌株的筛选方法。

本发明的目的之一是这样实现的：

高产PHA的卡巴耶罗氏菌株，所述菌株名称为Caballeronia sp.Y5702，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No.61153，保藏日期为2020年8月14日。

本发明的目的之二是这样实现的：

利用卡巴耶罗氏菌株生产PHA的方法中，发酵培养步骤为：以制备用发酵培养基在温度为25～30℃下培养45～55h；所述制备用发酵培养基中包括：葡萄糖30～50g/L，柠檬酸钠1～5g/L，硫酸铵2～6g/L，蛋白胨12～18g/L，KH₂PO₄·12H₂O 0.5～0.7g/L，CaCl₂ 0.05～0.15g/Lg，K₂HPO₄ 0.2～0.4g/L，微量元素：HBO₃ 0.01～0.03g/L，Na₂MoO₄ 0.01～0.03g/L；pH为6.8～7.2。