[发明专利]一种双抗原标记纳米金的方法

说明书

本发明涉及涉分析检测领域，公开了双抗原标记纳米金的方法，通过一次调节pH值可在同一纳米金表面标记新冠病毒N蛋白和鸡IgY。本发明提供的双抗原标记纳米金的制备方法，可以一步制备检测线和质控线所需的金标，不需要制备两种金标后再混合。使用时，只需将所制备金标喷到结合垫表面，烘干后便可直接使用，省时省力，提高了实验人员的工作效率；本发明提供了一种双抗原标记纳米金的方法，对分析测试领域具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种双抗原标记纳米金的方法，可用于胶体金免疫层析试纸条制备等领域。

背景技术

血清抗体检测方式主要有免疫胶体金层析法。其原理是将特异的抗原/抗体先固定于酸类纤维素膜或NC膜等的某一区带，当该干燥的酸类纤维素一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗原的区域时，样品中相应的抗体即与该抗原发生特异性结合。同时利用金粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处。当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色的斑点；

在试纸条制备中，抗原标记纳米金是很重要的一环，目前采取的构建新冠病毒N蛋白抗体试纸条时，金标制备主要由两种抗原分别修饰纳米金（即N蛋白标记，和质控线抗原标记如鸡IgY），最后按照一定比例混合而成。这种方法虽然简单，有效，但分开标记也会使得操作步骤繁琐。本发明提供一种双抗原标记纳米金的方法，通过依次标记，可实现一次离心洗涤即可获得所需金标。

附图说明：

图1：双抗原标记金标在相应抗体显色。

发明内容

本发明的目的是针对N蛋白与鸡IgY抗体分开标记纳米金的繁琐步骤，提供一种简单的双抗原标记金的制备方法；

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

所述双抗原标记方法为：鸡IgY修饰抗原纳米金，取1 mL纳米金，用0.2-0.5 M碳酸钾调节PH值为8.0-9.5，加入鸡IgY使得最终浓度为1-20 μg/mL，反应30-120分钟；

所述双抗原标记方法为：标记鸡IgY后，利用0.2-0.5 碳酸钾调节PH值为9.5-10.5，加入新冠病毒N蛋白至最终浓度为0.1-20μg/mL，反应30-120分钟；

所述双抗原标记方法为：标记鸡IgY和新冠N蛋白后加入BSA封闭液,使得最终BSA浓度为0.5%-3%，封闭30-120分钟。随后8000-10000rpm离心，弃上清，以pH=9.5的缓冲液洗涤，最后分散于20mM PB+3%蔗糖+0.1%吐温-20+1% BSA pH=8.5的缓冲液中。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明，有助于本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明；

实施例1：

双抗原标记纳米金制备：取1 mL纳米金，用0.5 M碳酸钾调节PH值为8.0，加入鸡IgY使得最终浓度为10 μg/mL，反应60分钟。随后继续以0.5 碳酸钾调节PH值为10.0，加入新冠病毒N蛋白至最终浓度为0.1-20μg/mL，反应60分钟。最后加入BSA使得最终BSA浓度为1%，封闭30-120分钟。随后8000-10000rpm离心，弃上清，以pH=9.5的缓冲液洗涤，最后分散于20mM PB+3%蔗糖+0.1%吐温-20+1% BSA pH=8.5的缓冲液中；

实施例2：

蛋白标记验证：以10 mM PB pH=7.5，3%的海藻糖作为抗体包被液，以1 mg/mLhis-Tag抗体在和1 mg/mL的兔抗鸡IgY分别在NC膜划线，37^oC下干燥。随后将所标记的双抗原标记纳米金以3 uL/cm的速率喷加到预处理的结合垫上，37^oC干燥12小时。依次将玻纤样品垫，结合垫，NC膜和吸水纸黏贴至PVC底板上。滴加样品稀释液（10 mM PB 3% NaCl， 1%BSA和0.1% PVP），观察his-Tag抗体划线和兔抗鸡IgY划线的NC膜变化。可观察到his-Tag抗体和兔抗IgY划线部位显示出红色（图1），表明蛋白标记成功。