[发明专利]高性能红色cAMP荧光探针及其应用

说明书

本发明属于生物检测领域。尤其涉及一种高性能红色cAMP（环磷酸腺苷）荧光探针，及其在活细胞中检测cAMP浓度的应用。本发明与绿色cAMP探针相比，R‑Flamp1m是红色探针，而红色探针能够与已有的大量绿色探针或者蓝光敏感的工具蛋白联合使用，可同时进行双色成像或者进行光学控制/荧光成像联用；在37℃培养细胞中，R‑Flamp1m的荧光亮度是现有红色cAMP探针Pink Flamindo及R‑FlincA的10倍以上，且具有更大的动态范围(ΔF/F0~5)，即具有更高的检测灵敏度。

技术领域

本发明属于生物检测领域。尤其涉及一种高性能红色cAMP（环磷酸腺苷）荧光探针，及其在活细胞中检测cAMP浓度的应用。

背景技术

环磷酸腺苷(cAMP)，是目前最大药物靶标G蛋白偶联受体(GPCR)家族的下游信使分子，细胞及活体水平的cAMP荧光成像是GPCR信号通路的基础研究和药物开发的重要方向。活细胞中cAMP荧光成像，是将cAMP荧光探针表达在细胞中，然后利用荧光显微镜检测探针荧光的强度变化。荧光探针是cAMP荧光成像分析的关键。cAMP荧光探针主要分为基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针及基于单个荧光蛋白的探针，后者动态范围较前者大且使用简单。

近几年，国际上知名实验室利用不同荧光蛋白、不同cAMP感应模块及不同的融合位点，开发了不同性能和光谱的cAMP单荧光蛋白探针（见表1），包括Tetsuya Kitaguchi 博士开发的Flamindo/Flamindo2/Pink Flamindo 探针、Anne Marie Quinn 博士开发的cADDis/Red cADDis 探针、Kazuki Horikawa 博士开发的R-FlincA探针及Justin Blau 博士开发的cAMPr 探针。

表1 不同性能和光谱的cAMP单荧光蛋白探针汇总。

目前，基于单个荧光蛋白的cAMP探针分为绿色和红色2小类，前者主要有Flamindo2、cADDis及cAMPr，后者主要有Pink Flamindo、Red cADDis及R-FlincA。对于绿色cAMP探针，我们已开发更高性能的探针G-Flamp1 (201911251920.X和202010354936.X)。相较于短波长的绿色探针，长波长的红色探针具有诸多优点：（1）红色探针能够与已有的大量绿色探针或者蓝光敏感的工具蛋白联合使用；（2）红色探针具有更低的荧光背景干扰、更小的光毒性和更深的组织穿透能力。但是，现有的红色探针具有以下不足：（1）在37°C培养哺乳动物细胞中亮度很低(如Pink Flamindo/R-FlincA)，不利于细胞的定位和神经元树突等微小细胞结构的观察；（2）在37°C培养哺乳动物细胞中动态范围（荧光亮度变化幅度ΔF/F0）很小(如Pink Flamindo/R-FlincA)，严重影响检测灵敏度； (3) 有些探针表达差，如R-FlincA在哺乳动物细胞中较长时间表达会形成斑点。

综上所述，本发明开发高性能红色cAMP荧光探针，提高其在实际应用中的亮度和动态范围，对于提高探测灵敏度具有重要意义。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种高性能红色cAMP（环磷酸腺苷）荧光探针R-Flamp1m，及其在活细胞中检测cAMP浓度的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明提供了一种cAMP荧光探针R-Flamp1m具有氨基酸序列SEQ ID NO:1。

本发明所述的R-Flamp1m具有如式Ⅰ所示结构：

His-mApple-N—连接肽1—mEpacl—连接肽2—mApple-C（式Ⅰ）。

其中，

所述His 为His标签(即Histag)，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。