[发明专利]一种南方根结线虫活体卵的分离方法

说明书

本发明公开了一种南方根结线虫活体卵的分离方法，本发明的方法将剥离附着在根系表面上根结线虫卵囊进行静止孵育、NaOCl离解、清洗、震荡、离心等处理，可以分离出纯净、单一种群分散的南方根结线虫卵粒，同时保证了卵的活性，具有推广应用的价值。

技术领域

本发明涉及农业植物保护领域，尤其涉及一种南方根结线虫活体卵的分离方法。

背景技术

根结线虫卵聚集在一起，以卵块包被的胶质存在，实验过程中往往要对根结线虫卵及二龄幼虫的孵化、发育及生物学特性进行研究，是重要的实验应用材料，但是采集的卵块很难进行分离成单个的卵，本技术主要对南方根结线虫卵进行高效分离，获得高纯度无杂质的线虫卵粒，并保证其活性，解决这一难题，为相关实验研究过程中提供应用材料。

根结线虫病主要由南方根结线虫(Meloidogyne incognita)侵染引起的，其发生范围包括我国各地区的果树蔬菜种植区。在根结线虫病害发生的种植区，产量损失一般达30％-50％，严重的达70％以上，有的甚至绝收；据估算，我国每年因根结线虫病(以南方根结线虫病为主)引起的损失高达500亿人民币。南方根结线虫专性寄生于植物根系，在破坏根组织正常功能形态后，可影响种苗根部对养分和水分的吸收，导致植株矮小，叶片枯黄，坐果少，果小畸形，进而造成植株营养生长和生殖生长的抑制，甚至死亡。南方根结线虫的侵染会对植株根系造成伤口，有利于其他植物病原物的复合侵染，植株对病原真菌和细菌的易感性增强，在种植过程中，农业生产经营者往往面临的是更严重的复合病害发生。目前，涉及对南方根结线虫生物学，发生规律及综合防治等方面的研究需要对根结线虫的数量、种群密度进行准确评估，其中卵的数量是一个重要的指标，这对根结线虫病害的治理具有重要的现实意义。

根结线虫的分离方法较多，有贝曼漏斗法、浅盘法、离心法、离心漂浮法及淘洗染色方法，这些方法各有优缺点，其中贝曼漏斗法和浅盘法只能分离土壤中活动的2龄线虫幼虫，但不能分离卵；离心法、离心漂浮法和淘洗染色方法只能分离土壤中线虫幼虫及分散的卵，不能分离附着在根系上的卵囊，而且往往不同种类线虫种类的卵个体混合存在，不能保证卵是活体。而根结线虫多以卵囊形式附着在根系表面或土壤颗粒上度过不利环境，所以传统的方法均不能准确评估根结线虫数量情况。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种南方根结线虫活体卵的分离方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括以下步骤：

①采集植物病根后，将其在实验室进行保湿放置；

②将植物根组织进行冲洗，在体视镜下，用镊子挑取足量的线虫卵囊，并将其置于含有无菌水中的离心管中；

③将含有线虫卵囊的离心管进行旋转离心，用移液器充分移除上清液；

④加入次氯酸钠溶液处理线虫卵囊，期间将样品在涡旋震荡器上反复震荡；

⑤将样品旋转离心，后用移液枪吸取上清液，弃去；

⑥加入无菌水，涡旋震荡，使卵囊样品充分混匀，旋转离心，弃上清液；

⑦重复步骤⑥，用无菌水将线虫卵囊样品充分洗涤3-5遍；

⑧加入无菌水，将样品充分混匀后于实验台上静置；

⑨用移液器吸取离心管上层的线虫卵粒悬浮液，并将其移至新的离心管中；

⑩体视镜下对线虫卵粒进行计数，并计算其对应的浓度；

根据后续实验需求，移取相应体积的卵粒悬浮液进行其它条件处理和孵化实验。

优选的，所述步骤②和步骤③的离心管均为1.5mL离心管。