[发明专利]一种高效装载特异性miRNA的功能性外泌体构建方法

说明书

本发明公开了一种高效装载特异性miRNA的功能性外泌体构建方法，为了使外泌体能够更加高效地携带具有特定调控功能的miRNA，以更加精准高效地发挥靶向调控作用，利用MS2噬菌体衣壳蛋白，编辑构建特定miRNA分子的捕捉元件，重编程胎盘间充质干细胞，使其分泌的外泌体高效装载目的miRNA分子，从而递送至组织细胞发挥有效调控作用，为将来实现特异性精准治疗提供一种新的策略。

技术领域

本发明涉及生物医用材料和细胞分子治疗领域，具体涉及一种高效装载特异性miRNA的功能性外泌体构建方法。

背景技术

随着细胞分子治疗的快速发展，外泌体治疗成为生物医疗领域研究的热点，并受到广泛的关注。外泌体是细胞外分泌囊泡中的一员，它可以作为运输载体，携带细胞内特定的蛋白和RNA等成分，通过融合到靶细胞膜或者靶细胞胞吞作用摄入，将RNA等分子直接递送到靶细胞内部，对受体细胞组织发挥有效调控作用。相比于干细胞治疗，干细胞来源的外泌体，不仅含有干细胞分泌的多种有效成分，而且可以避免异种来源细胞表面抗原带来的一过性排异反应，在临床治疗应用上更加安全。

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因，在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用。然而，单独的miRNA分子在体外稳定性差，并且需要进入细胞内部才能发挥调控作用，而外泌体恰好可以作为miRNA的载体在细胞间起到有效的递送作用。由于外泌体自身携带的细胞内蛋白和RNA数量有限、成分复杂，特异性作用效率不高。以往的方法单纯通过脂质体转染或电转染等方式使细胞过表达miRNA，仍是依靠外泌体自组装能力携带miRNA分子，装载效率依然有限。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种高效装载特异性miRNA的功能性外泌体构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效装载特异性miRNA的功能性外泌体构建方法，包括如下步骤：

S1、利用MS2噬菌体衣壳蛋白，将MS2蛋白编码基因与外泌体Lactadherin蛋白中的C1C2结构域相连接，构建C1C2-MS2(CM)慢病毒质粒；

S2、将用于与MS2铆合的位点pac蛋白与目的miRNA相连，构建pac-miRNA-pac(p-miRNA-p)慢病毒质粒，其两端均具有与MS2结合的pac位点；

S3、将步骤S1和步骤S2获得的两种质粒包装为慢病毒感染间充质干细胞，通过抗性药物筛选获得确定的稳转系，留取干细胞上清液，利用超速离心法提取外泌体。

进一步地，步骤S3的具体过程：

S3.1、将C1C2-MS2慢病毒质粒和pac-miRNA-pac慢病毒质粒分别利用三质粒慢病毒包装系统，通过转染293T细胞，包装得到CM慢病毒和p-miRNA-p慢病毒；

S3.2、无菌条件下，将胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞PMSCs加入含有干细胞培养基中，置于37℃、CO₂体积分数为5％的培养箱内孵育；所述干细胞培养基中含有质量百分比10％的胎牛血清；

S3.3、通过CM慢病毒感染PMSCs，48小时后利用含有1.0ug/mL puromycin的培养基进行药物筛选，10-14天后获取稳定表达MS2的细胞系CM-PMSCs；

S3.4、将CM-PMSCs进一步感染p-miRNA-p慢病毒，48h后利用含有600μg/mL G418的培养基进行药物筛选，2周后获取稳定表达目的miRNA的细胞系CM-miRNA-PMSCs；