[发明专利]一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法

说明书

一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法属于中药材鉴定技术领域。本发明以电喷雾串联质谱法(ESI‑MS/MS)为技术手段检测鹿茸鲜品和传统加工品各6批中的化学成分，通过ELISA法测定各样品促进大鼠睾丸间质细胞的睾酮分泌量，利用化学计量法进行数据分析，利用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS‑DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS‑DA)方法相互关联，用以筛选出鹿茸促进睾丸间质细胞分泌睾酮的主要成分，保证了实验结果的准确性。该方法不仅能够为鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分研究提供依据，也为其他中药成分的研究提供了一定的思路。

技术领域

本发明属于中药材鉴定技术领域，特别是涉及到一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法。

背景技术

鹿茸(Cervi Cornu Pantotrichum)是我国传统名药之一,为鹿科动物梅花鹿(Cervus nipport Temminck)或马鹿(Cervus elaphus Linnaeus)的雄鹿未骨化密生鸾毛的幼角。在我国有几千年的应用历史。味甘、咸，性温。归肾、肝经。始载于《神农本草经》列为中品，具有壮肾阳，益精血，强筋骨等功效。睾丸间质细胞是一种存在于睾丸间质内部的内分泌细胞，主要功能是分泌睾酮，分泌的睾酮含量占睾酮总量的95％。改善雄激素的分泌量和调节生理机能是通过睾丸间质细胞分泌睾酮能力和增殖能力来表现的，故鹿茸的壮阳生精功效与机体睾酮水平密切相关。

电喷雾电离串联质谱技术作为一种软电离技术，已成为研究天然产物结构的重要手段。直接进样电喷雾串联质谱法只需要很少的样品量，并且不需要对被分析物进行分离处理，节省了分析步骤，提高了检测效率。如能将其与化学计量学方法结合应用，就可将被分析中药等复杂体系中化学成分组成及结构与其对应活性相关联，从而达到快速筛选活性成分的目的。

鹿茸的药效物质基础主要为多肽类成分，仅考察氨基酸，无法全面有效的筛选出鹿茸中促睾酮分泌的活性成分，所以本发明提出了一种以电喷雾串联质谱法(ESI-MS/MS)筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法,用于解决仅考察氨基酸，无法全面有效的筛选出鹿茸中促睾酮分泌的活性成分的技术问题。

一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法，包括以下步骤，并且以下步骤顺次进行，

步骤一、制备鹿茸鲜品以及鹿茸传统加工品样品；

步骤二、制备鹿茸鲜品冻干粉以及鹿茸传统加工品样品冻干粉；

步骤三、制备质谱测定用的鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液；

步骤四、对鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液分别进行电喷雾串联质谱测定，获得鹿茸鲜品滤液的一级质谱指纹谱图和鹿茸传统加工品滤液的一级质谱指纹谱图，将各图谱导出，获得鹿茸鲜品滤液的一级质谱数据、鹿茸传统加工品滤液的一级质谱数据、鹿茸鲜品滤液的离子峰二级质谱数据和鹿茸传统加工品滤液的离子峰二级质谱数据；

步骤五、分离培养活性测定用的大鼠睾丸间质细胞；

步骤六、利用小鼠睾酮(T)试剂盒和显色后的吸光值分别测定鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液促进大鼠睾丸间质细胞的睾酮分泌量；

步骤七、将所述步骤四获得的鹿茸鲜品滤液的一级质谱数据、鹿茸传统加工品滤液的一级质谱数据、鹿茸鲜品滤液的离子峰二级质谱数据和鹿茸传统加工品滤液的离子峰二级质谱数据用Excell表格整理并导入Simca-p14软件通过多元统计分析法获得鹿茸促进睾丸间质细胞分泌睾酮的潜在活性成分，并结合鹿茸鲜品滤液的离子峰二级质谱数据和鹿茸传统加工品滤液的离子峰二级质谱数据获得鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分结构。

所述步骤一中制备鹿茸鲜品以及鹿茸传统加工品样品的方法为：