[发明专利]一种靶向淋巴瘤细胞的外泌体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种靶向淋巴瘤细胞的外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:

步骤S1：外泌体纯化及表面修饰，得到表面修饰的外泌体：

步骤S11：提取外泌体前12-48h，将外泌体来源细胞的培养液更换为不含血清的培养基，培养24-48h后，收集细胞悬液；

步骤S12：将所述步骤S11得到的细胞悬液离心，取上清后进行第二次离心，再取上清；第三次离心后，将上清移至100kD超滤管中离心浓缩，将浓缩液超高速离心后吸弃上清，重悬洗涤后，再次超高速离心，吸弃上清，1×PBS溶液重悬，得到分离纯化的外泌体悬液；

步骤S13：将所述步骤S12得到的外泌体悬液与3-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)试剂在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1～2小时，通过超高速离心法离心纯化得到表面修饰马来酰亚胺基团的外泌体，其中所述外泌体悬液与MBS试剂体积比为50：1；

步骤S2：富含巯基的CD22-F(ab’)2抗体片段的制备：

步骤S21：使用无花果蛋白酶水解anti-CD22单抗得到F(ab’)2抗体片段，随后将该反应体系纯化分离，再通过高效液相色谱法收集第一个蛋白峰，得到CD22-F(ab’)2抗体片段；

步骤S22：将所述CD22-F(ab’)2抗体片段与Traut’s试剂在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1～2小时，超滤离心，得到富含巯基的CD22-F(ab’)2抗体片段，其中所述CD22-F(ab’)2抗体片段与Traut’s试剂的浓度比为50:1；

步骤S3：将所述表面修饰的外泌体与所述CD22-F(ab’)2抗体片段混合，在37±0.5℃的避光环境中震荡反应12～18小时，经超滤离心洗涤，得到连接CD22-F(ab’)2抗体片段的外泌体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述外泌体来源细胞为人肾上皮细胞系的293T细胞。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S12中，细胞悬液离心以300g，10min，4℃条件进行，第二次离心以2000g，10min，4℃条件进行，第三次离心以12000g，30min，4℃进行。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S21中的水解条件为：pH6.0下，10mM柠檬酸盐缓冲液中加入4mM半胱氨酸和5mM EDTA，与无花果蛋白酶及anti-CD22单抗在37℃下共同孵育24小时。

5.权利要求1-4任一所述的靶向淋巴瘤细胞的外泌体的制备方法制备得到的外泌体。

6.权利要求5所述的外泌体在制备靶向淋巴瘤细胞载药体系中的应用，其特征在于，所述应用具体为将所述连接CD22-F(ab’)2抗体片段的外泌体与抗肿瘤药物在37±0.5℃的共孵育。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为蒽环类抗肿瘤药物或烷化剂类抗肿瘤药物的任一种，抗肿瘤药物的浓度为1～2mg/mL，所述抗肿瘤药物与连接CD22-F(ab’)2抗体片段的外泌体的体积比为(1～4):1。