[发明专利]一种牛磺熊去氧胆酸的生物催化制备方法

说明书

本发明公开了一种牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的生物催化制备方法，第一步利用TCDCA氧化酶将TCDCA脱氢氧化成牛磺7‑酮石胆酸（T‑7‑KLCA），并利用酮还原酶催化丙酮生成异丙醇提供NADP+/NAD+的辅酶再生；第二步利用T‑7‑KLCA还原酶将T‑7‑KLCA还原成TUDCA，并利用异丙醇脱氢酶催化异丙醇生成丙酮提供NADPH/NADH的辅酶再生。此双酶联反应在第一步反应结束后简单处理就可以进行第二步反应，不需要中间提纯；反应中NADP+/NAD+加量少，且丙酮和异丙醇在两步反应中互为底物和产物，并可以回收利用，极大降低了生产成本和环保压力。为牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）双酶联反应生成TUDCA提供了一种经济、高效、环保的大规模工业化生产新工艺。

技术领域

本发明涉及生物催化领域，具体涉及牛磺熊去氧胆酸的生物催化制备方法和辅酶再生体系。

背景技术

牛磺熊去氧胆酸（TUDCA），化学名称为3α，7β二羟基胆烷酰-N-牛磺酸，是由熊去氧胆酸（UDCA）的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸。1902年自熊胆中发现，为熊胆中主要胆汁酸，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。

目前的TUDCA的工业化生产普遍为化学工艺，虽然近些年工艺不断优化改进，但总体来说化学法工艺复杂，收率低，成本高，环保和安全性差，这也是TUDCA价格居高不下的直接原因。这几年随着国内酶催化市场的普及，不少厂家及科研单位开始尝试酶催化生产TUDCA，但目前公开的文献和专利大部分仅是酶催化工艺的初步尝试，距离工业化生产还有不少距离。专利CN107287272A采用同时表达7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)基因的大肠杆菌进行液体发酵，在发酵过程中将牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸，此种方法虽然能够得到最终产品，但是时间过长，专利表述1～3天（优选2～3天），且在工业化大规模重组大肠杆菌发酵过程中很容易自溶，一旦自溶底物的回收利用将是一个问题，因此此种方法仅是酶催化工艺的一种探讨，经济性和稳定性很难达到工业化生产的需求。专利CN102994604B采用重组酶7α-HSDH和7β-HSDH对胆汁/粉中的结合态CDCA（包括TCDCA）进行原位催化生成结合态UDCA（包括TUDCA），但是其没有使用辅酶再生系统，两步酶催化反应中加入了大量的NADP+和NADPH，仅此一项成本已经超过了产物的价值，而且其实施例中转化率在55%～60%之间，转化率太低，后提取难度大，收率低，不具备放大生产条件。专利CN109402212A两步酶法反应中的辅酶再生体系，第一步用的乳酸脱氢酶催化和α-酮酸生成乳酸，同时将NADPH转化成NADP+，第二步利用葡萄糖脱氢酶将葡萄糖转化成葡萄糖酸钠，同时将NADP+转化成NADPH，这两步生成大量的乳酸和葡萄糖酸钠，无法循环利用且不易回收，对后期污水处理产生很大压力，既不经济也不环保。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明通过采用双酶联催化反应，实现了丙酮-异丙醇循环辅助牛磺熊去氧胆酸的生物催化制备方法，该方法的工艺简单，成本低，转化率高，后处理更容易，更加环保。同时丙酮和异丙醇易蒸馏回收，降低成本及减少后续处理工序。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案。

一种牛磺熊去氧胆酸的生物催化制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）第一步酶催化反应：在NADP+或NAD+的参与下，利用酮还原酶催化丙酮生成异丙醇，利用TCDCA氧化酶将TCDCA脱氢氧化成牛磺7-酮石胆酸T-7-KLCA，获得第一步酶反应液；

（2）第二步酶催化反应：第一步酶反应液去除剩余的酶后，加入一定量的异丙醇，利用异丙醇脱氢酶催化异丙醇生成丙酮提供NADPH/NADH的辅酶再生，利用T-7-KLCA还原酶将T-7-KLCA还原成TUDCA。