[发明专利]一种快速、大通量兔多克隆抗体体外生产方法

说明书

本发明提供了一种快速、大通量兔多克隆抗体体外生产方法，主要利用B淋巴细胞分离技术，通过体外扩增培养实现兔多克隆抗体的快速、大量和稳定生产，并优化了B淋巴细胞培养基，采用胰蛋白胨并搭配空白兔血清制备B淋巴细胞培养基，大幅提高B淋巴细胞的分化和增殖量，为兔多克隆抗体的体外生产提供细胞量的基础。通过本发明提供的方法，兔子在第三次免疫后马上可以采血进行生产，产品生产周期大幅缩短，获得的兔多克隆抗体产量是传统方法中同体积血清产量的30倍以上，具有周期短、产量大、单位成本低、质量稳定等优势，适于大规模生产应用。

技术领域

本发明涉及抗体制备领域，具体而言，本发明涉及一种快速、大通量兔多克隆抗体体外生产方法。

背景技术

兔多克隆抗体是指兔子的免疫系统由于抗原的刺激作用产生的抗体。而抗原往往是由多个抗原决定簇组成的，一个兔子B淋巴细胞只能接受该抗原的一种抗原决定簇刺激，从而产生一种对应的特异性抗体，这种抗体称之为单克隆抗体(MonoclonalAntibody)。所以多种抗原决定簇刺激兔子免疫系统，对应地就会生产多种特异性单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。兔子免疫系统产生的抗体对于小鼠、大鼠等其他物种有着亲合力强、特异性好、效价高的优势，因此兔多克隆抗体为科研开发、药物筛选和临床诊断提供了最佳抗体试剂来源。

抗体体外生产是指利用特定人工环境和培养试剂对分泌抗体的细胞或组织进行机体外培养以获得特异性抗体。常见的抗体体外培养技术有杂交瘤细胞培养技术、重组抗体培养技术等，但这种技术往往使用在单克隆抗体生产。

传统方法的兔多克隆抗体生产方法主要是用抗原大规模免疫兔子，然后在第四次免疫后开始收集20-30ml兔子血清，之后取血都需要重复免疫、休息、采血、休息的循环周期。因此如果收集100ml的兔子血清需要花费105天。且因为兔子健康、寿命等限制，多抗产品往往需要重新免疫新兔子造成产品批次差异大，质量不稳定的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种利用B淋巴细胞分离技术，通过体外扩增培养实现兔多克隆抗体的快速、大量和稳定生产的方法，并优化了B淋巴细胞培养基，采用胰蛋白胨并搭配空白兔血清作为特殊添加物，大幅提高B淋巴细胞的分化和增殖量，为兔多克隆抗体的体外生产提供细胞量的基础。通过本发明提供的方法，兔子在第三次免疫后马上可以采血进行生产，产品生产周期大幅缩短，获得的兔多克隆抗体产量是传统方法中同体积血清产量的30倍以上，具有周期短、产量大、单位成本低、质量稳定等优势，适于大规模生产应用。

一方面，本发明提供一种快速、大通量兔多克隆抗体体外生产方法，其特征在于，包括步骤：

1)免疫后的兔子上获得外周血单核细胞悬液；

2)利用包被抗原的高亲和力平皿获得抗原特异性B淋巴细胞；

3)获得优化后的B淋巴细胞培养基；

4)采用步骤3)优化后的B淋巴细胞培养基扩大培养特异性B淋巴细胞；

5)亲和纯化上清，快速获得大量兔多克隆抗体产品。

进一步地，步骤3)所述的优化后的B淋巴细胞培养基为：RPMI1640+10％空白兔血清+1％胰蛋白胨+添加剂A，所述添加剂A为替代Th细胞活化B淋巴细胞的重要细胞因子。

现有的B细胞培养基为含有10％FBS的RPMI1640，同时加入添加剂A(添加剂A为替代Th细胞活化B细胞的重要细胞因子，例如CD40L、IL6等细胞因子，本发明优选使用的添加剂A为CD40L和IL6。

经优化后的B细胞培养基为：RPMI1640+10％空白兔血清+1％胰蛋白胨+添加剂A。其中的胰蛋白胨作为一种氮源能更好的为合成抗体提供营养，空白兔血清作为富含兔源细胞因子添加剂能更好的刺激兔子B细胞的分裂增殖。