[发明专利]一种生物单细胞透射电镜样品的制备方法

说明书

本发明公开了一种生物单细胞透射电镜样品的制备方法，将生物单细胞培养液、无菌含铅溶液共同置于培养基中，密封、摇匀后进行培养，得到样本溶液；取培养后的样本溶液进行固定处理、漂洗、脱水处理、包埋切片处理，得到TEM样品。本发明成功解决了现有样品预处理方法过程复杂、使用药剂毒性强、单细胞个体内超微结构难以清晰显像的问题。

技术领域

本发明涉及一种透射电镜样品的制备方法，特别是涉及一种生物单细胞透射电镜样品的制备方法。

背景技术

生物单细胞细胞结构简单，生长周期极短，研究价值极大。研究生物的分布规律有利于发掘丰富的菌种资源，推动进化，分类的研究和开发利用；研究生物与植物间的相互关系，有助于开发新的农药，生物肥料，为防止人和动物植物的病害提供理论依据；研究生物在自然界物质循环中的作用，有助于阐明地质演变和生物进化中的许多机制，为开发生物能源和促进大自然的生态平衡等提供科学的基础，因此如何借助现代科学技术方法研究微观世界变得十分重要。但是由于生物的直径单位一般为数百纳米到微米范围，且细胞结构复杂、分裂速度极快，人类肉眼难以观察。

通常，透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy，TEM)是研究生物超微结构的重要工具。其分辨率可高达1-2nm，可以直接观测到大部分生物单细胞的细小结构，满足单细胞微生物的观测需求，应用范围极广。透射电镜成像是通过电子枪发出高速电子束经过1-2级聚光镜会聚后均匀照射到样品的观察区上，入射电子与样品会发生碰撞与非碰撞，由于样品很薄，大部分电子穿透样样品，其强度分布与所观察样品区的形貌、组织、结构一一对应。投射出样品的电子经过物镜、中间镜和投影镜的三级磁透镜放大投射在观察图像的荧光屏上，荧光屏把电子强度分布转化为人眼可见的光强分布，于是在荧光屏上显出与样品形貌、组织、结构相应的图像以供使用者观察。

TEM样品的制备是准确观察到细胞中的微观结构的重要前提。常规的超薄切片技术的制样过程比较复杂，一般包括固定、清洗、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤，且采用该方法制备的TEM样品，在电镜下往往难以准确区分细胞内的各细胞器位置及形态，导致失败率较高。并且，现有样品预处理方法过程复杂、使用药剂毒性强、细胞内超微结构难以清晰显像。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种生物单细胞透射电镜样品的制备方法，可以解决现有技术制备单细胞TEM样品，失败率较高，且细胞内超微结构难以清晰显像的技术问题。

技术方案：本发明的一种生物单细胞透射电镜样品的制备方法，包括如下步骤：

(1)将生物单细胞培养液、无菌含铅溶液共同置于培养基中，密封、摇匀后进行培养，得到样本溶液；

(2)取培养后的样本溶液进行固定处理，漂洗；

(3)将经固定处理后的样品进行脱水处理、包埋切片处理，得到TEM样品。

优选地，所述生物单细胞为藻类、细菌、真菌、放线菌、动物细胞或植物细胞。

其中，步骤(1)中，采集的生物单细胞样品的体积小于1mm³；培养基中铅离子的溶液的浓度为100-5000ppb，满足低浓度Pb对于活体藻类细胞的影响极小的原则；样本溶液的pH控制在6.8～7.2。

含铅溶液为Pb(NO₃)₂、PbCl₂或PbSO₄。

其中，步骤(2)中，固定处理包括前固定处理和后固定处理，前固定处理包括向样本溶液中加入戊二醛溶液，室温避光条件下固定3-5小时，漂洗；后固定处理包括加入锇酸，避光条件下固定1-3小时，漂洗。

步骤(3)中，TEM样品的切片厚度为60～100nm。