[发明专利]从COVID-19康复者血浆中纯化抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的方法

权利要求书

1.制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体制剂的方法，该方法包括如下步骤：

(1)提供S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱；

(2)利用封闭式多细胞组分自动化分离系统快速分离外周血以获得血浆组分；

(3)使步骤(2)所得血浆使用S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱进行抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的制备和纯化，得到抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体制品，

其中：

步骤(2)包括如下步骤：

2a)、通过静脉穿刺法采集的SARS-CoV-2自然感染者并通过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的康复者的外周血250mL，置血液采集袋内，将血液采集袋置于水平摇床上充分混匀15min；

2b)、使用封闭式多细胞组分自动化分离系统，将一次性使用分离杯的塑料针头插入到血液采集袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的40mL血液自然流入分离杯内的中央舱室；在加入血液前所述中央舱室内预先添加有0.4mL分离助剂；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离，再使该一次性分离杯置于水平摇床上充分混匀10min；所述分离助剂是包含油酸钠和氯化镁的灭菌水溶液，其中油酸钠浓度为5%，氯化镁浓度以镁离子计为0.25mol/L；所述封闭式多细胞组分自动化分离系统是ThermoGenesis Corp.生产的PXP® System；

2c)、将一次性分离杯配平后放置于可编程的离心机进行离心操作，并按照如下程序设定离心机的参数：

在离心的初始高速部分即2000RCF期间，外周血样本中的细胞通过密度分层在一次性使用分离杯中分为三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；

将速度降低至50RCF，并且在此第一次低速离心期间，大部分红细胞被引导至红细胞回收舱；

短暂增加速度至500RCF，以进一步将处理室中的细胞分层；

再次降低至50RCF，进一步除去红细胞；

在采集血浆之前，相对离心力短暂增加至250RCF，在此期间，细胞浓缩层和血浆进一步分层；

再次降低至50RCF，细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，使大部分血浆保留在中央舱室中；

2d)、离心机减速并停止旋转，在一次性分离杯中分别单独采集红细胞、细胞浓缩层、血浆；

2e)、利用无菌接管机连接一次性分离杯上中央舱室的管路和转移袋的管路，将中央舱室中的分离后的血浆转移至转移袋内；用无菌接合仪焊接管路后，将分离后的血浆用亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后在6h内快速冻结至-20℃以下，保存，得到血浆，其备用于制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的制剂；

步骤(3)是照如下方式操作的：

3a)取血浆，用Mab Loading Buffer稀释10倍，再用0.22μm滤膜过滤，得到稀释血浆；所述Mab Loading Buffer为包含如下组分的水溶液：Na₂HPO₄ 5.12g/L、NaH₂PO₄ 0.872g/L、NaCl 9g/L，pH7.2；

3b)预备亲和层析纯化仪，将亲和层析柱装入纯化仪上，依次用Mab Elution Buffer和Mab Loading Buffer冲洗并平衡管路及层析柱；所述Mab Elution Buffer为包含如下组分的水溶液：柠檬酸17.22g/L、柠檬酸三钠5.3g/L，pH3.0；

3c)平衡好后，将稀释血浆以5mL/min的流速上样1个柱体积；

3d)上样完成后，用增补添加了2.6g/L甘氨酸的Mab Loading Buffer继续冲洗亲和柱，洗去未结合的杂蛋白，直至紫外基线平衡；所述添加了2.6g/L甘氨酸的Mab LoadingBuffer的配方为：Na₂HPO₄ 5.12g/L、NaH₂PO₄ 0.872g/L、NaCl 9g/L、甘氨酸2.6g/L，pH7.2；

3e)接着，使用Mab Elution Buffer洗脱目的抗体，收集抗体洗脱液的目的蛋白峰，将所得抗体洗脱液调节pH至7.0±0.1；

3f)将收集的抗体洗脱液装入3万分子量的透析袋，用PB缓冲液进行透析，透析完毕后用聚乙二醇进行浓缩，接着用注射用水进行超滤脱盐处理，使得到蛋白浓度大于1mg/mL的抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体，将其用0.22μm滤膜过滤，所得滤液为多克隆抗体原液，即作为成品的抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体；任选的

3g)将以上所得多克隆抗体原液加氯化钠溶解或者用无菌氯化钠注射液稀释配制成可供静脉注射使用的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的注射液。