[发明专利]一种短体线虫培养及分离的方法

说明书

本发明涉及一种培养短体线虫及分离的方法，其包括如下步骤：1)将所述线虫接种到培养基质上；2)在低于所述线虫繁殖的温度下处理所述线虫；3)在繁殖温度下培养所述线虫；4)收获所述线虫。

技术领域

本发明涉及短体线虫培养及分离的方法。

背景技术

小麦根腐线虫(Root lesion nematodes)病在世界各地都有危害，引起该病害的病原线虫为根腐线虫，属短体线虫属(Pratylenchus spp.)，是仅次于根结线虫和孢囊线虫的世界第3大线虫病害。在国外关于短体线虫危害麦类作物的大量报道中，主要涉及的物种包括六裂短体线虫(P.hexincisus)、卢斯短体线虫(P.loosi)、落选短体线虫(P.neglectus)、穿刺短体线虫(P.penetrans)、斯克里布纳短体线虫(P.scribneri)、桑尼短体线虫(P.thornei)和玉米短体线虫(P.zeae)等。对在上述几种短体线虫，国内除了六裂短体线虫在小麦上还未发现，其余几种都有，另外还在小麦上发现有草地短体线虫、咖啡短体线虫、敏捷短体线虫。该病原线虫危害的作物比较多，寄主比较广泛，在小麦、燕麦、水稻、玉米、小米、高粱、大豆、油菜、花生、棉花、苎麻、马铃薯、甘薯、茄子、番茄、草莓、桃、核桃、梨树、蒺藜等作物上均有发现。

线虫的人工培养有多种方法，包括利用真菌和细菌等微生物培养法、活体植株接种培养法、寄主愈伤组织培养法等。其中，现有的愈伤组织培养法的缺点是：1)在制备胡萝卜片前的消毒过程比较繁琐，甚至有的还用有毒性的消毒液---升汞消毒，不安全；2)单片愈伤组织培养出来的线虫群体数量太低，而且培养时间较长；3)对培养出来的线虫，位于愈伤组织内部的线虫在分离上有困难；3)在分离愈伤组织内部线虫时通常伴有大量的已死亡的线虫，导致对后续实验的干扰非常大，而且还耗费大量的时间和劳力，不利于试验正常进行。不同类型线虫的培养所采用的具体方法取决于其生物学特性。

经愈伤组织培养后线虫分离方法也不尽相同。例如，1)通过采用解剖刀将胡萝卜愈伤组织切成细小碎片，并用研磨杵捣碎较大碎片后用无菌水冲洗培养皿壁上的线虫，来收集愈伤组织培养好的线虫。2)先把胡萝卜愈伤组织切碎放入搅拌器中，加入适量自来水搅拌5s，间隔60s，重复3次。将搅拌后得到的悬浮液通过120目、500目组合筛，用自来水反复冲洗后，用洗瓶冲洗收集500目筛上的线虫及卵到烧杯中。3)分离胡萝卜愈伤组织培养花生茎线虫的方法是把胡萝卜愈伤组织放入搅拌器(康华HJ-1型)中，加入适量的水进行搅拌，将搅拌后的悬浮液分别过100目、300目、500目组合的线虫过滤筛，用洗瓶反复冲洗300目和500目筛上的线虫至烧杯中。4)先将培养皿盖子上的线虫用清水冲洗到烧杯中，接下来的步骤类似于上述3)。然而，这些方法都涉及在分离线虫前采用大量的机械的方法把胡萝卜愈伤组织粉碎，这对线虫造成的伤害很大，而且分离出来的线虫群体溶液中会有大量的胡萝卜色素和细小的胡萝卜组织残渣在内，即使通过多次洗涤也很难除去这些细小的胡萝卜组织残渣，更主要的是含有大量的死亡的线虫，会给后续的试验用虫造成清洗或分离上的困难，耗费大量时间和劳力。

发明内容

本发明提供了一种培养短体线虫属(Pratylenchus)中的至少一种线虫的方法，其包括如下步骤：

1)将所述线虫接种到置于容器内的培养基质上；

2)在低于所述线虫繁殖的温度下处理所述线虫；

3)在繁殖温度下培养所述线虫；

4)收获所述线虫。

在一个具体实施方式中，所述线虫为斯克里布纳短体线虫(Pratylenchusscribneri)。

在一个具体实施方式中，在步骤2)中，低于所述线虫繁殖的温度为13至20℃。

在一个具体实施方式中，在步骤2)中，低于所述线虫繁殖的温度为15至17℃。