[发明专利]基于酶诱导的电化学免疫传感器的制备方法及应用

说明书

本发明公开了基于酶诱导的电化学免疫传感器的制备方法及应用，该制备方法包括：(1)清洗玻碳电极；以及（2）构建探针；所述构建探针具体为：首先，滴加氨基甲酸乙酯包被原（Ag）到玻碳电极孵育；然后，将玻碳电极浸泡BSA溶液；接着，将玻碳电极浸泡在氨基甲酸乙酯间接兔多抗（Ab1）中孵育；最后，将玻碳电极浸泡在鼠多抗‑碱式磷酸酶（Ab2‑ALP）孵育。本发明开发了一种基于碱式磷酸酶（ALP）诱导Cu²⁺/Cu⁺转化的竞争性电化学免疫传感器，该竞争性电化学免疫传感器可用于灵敏的检测氨基甲酸乙酯。与传统的酶联免疫吸附法相比，本发明经过三轮信号放大，即：ALP酶的催化反应、Cu²⁺/Cu⁺转化、方波伏安法信号输出，以此来提高检测检测灵敏度。

技术领域

本发明属于电化学技术领域，特别涉及基于酶诱导的电化学免疫传感器的制备方法及应用。

背景技术

氨基甲酸乙酯（尿烷）被列为2A类致癌物质，是一种广泛存在于发酵食品尤其是发酵类酒精饮品的化学污染物。为了人类健康，许多国家规定了氨基甲酸乙酯的法定限量，例如加拿大，美国，法国，日本等，已将酒精饮料中氨基甲酸乙酯的法定限量标准定为15-1000g/L。目前，国内外检测氨基甲酸乙酯的常用方法主要有气相色谱-质谱（GC-MS）、高效液相色谱-质谱（LC-MS）、高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)等方法，但这些方法主要依赖大型仪器、预处理要求高、步骤复杂、需专业人员操作、检测费用高、很难适应许多场合快速检测的需要。因此，降低检测成本、灵敏、快速检测氨基甲酸乙酯的含量成为目前需要解决的问题，电化学生物传感器的发展有望解决目前存在的问题。

在电化学生物传感器中，例如，分子印迹电化学传感器用于检测氨基甲酸乙酯，稳定性好，特异性强等优点，但是氨基甲酸乙酯在食品中的含量较低时，需要较强的灵敏度。显然，分子印迹电化学传感器的灵敏度达不到检测的要求。

发明内容

为了提高低含量氨基甲酸乙酯的检测灵敏度，本发明提供了基于酶诱导的电化学免疫传感器的制备方法及应用，所提供的基于酶诱导的电化学免疫传感器可用于检测食品中的氨基甲酸乙酯。

本发明提供的基于酶诱导的电化学免疫传感器的制备方法，包括步骤：

（1）清洗玻碳电极；

（2）构建探针，具体为：

首先，滴加氨基甲酸乙酯包被原（Ag）到玻碳电极，孵育1h-24h，用0.1mol/L且pH7.4的PBS缓冲液清洗三次，洗掉未固定在玻碳电极上的氨基甲酸乙酯包被原；

然后，将玻碳电极浸泡质量浓度1%的BSA 溶液（牛血清蛋白溶液）中封闭0.5h-1h用0.1mol/L且pH7.4的缓冲液清洗三次，洗掉未结合的BSA；

接着，将玻碳电极浸泡在pH7.4的PBS缓冲液配制的氨基甲酸乙酯间接兔多抗（Ab1）中0.5h-1h，用0.1mol/L且pH7.4的PBS缓冲液清洗三次，洗掉未结合的氨基甲酸乙酯间接兔多抗；

最后，将玻碳电极浸泡在用鼠多抗-碱式磷酸酶的缓冲液配制的鼠多抗-碱式磷酸酶（Ab2-ALP）孵育0.5h-1h，用0.1mol/L且pH7.4的PBS缓冲液清洗三次，洗掉未结合的鼠多抗-碱式磷酸酶；

所述PBS缓冲液的配制为：

用0.2mol/L的Na₂HPO₄与0.2mol/L的NaH₂PO₄配制成所需pH和所需浓度的PB溶液，再加入浓度0.9%质量浓度的NaCl，配制成PBS缓冲液。

所述鼠多抗-碱式磷酸酶的缓冲液的配制：