[发明专利]一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法

说明书

本发明公开一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，属于生物医药技术领域。本发明所述方法利用MUC16特异性的sgRNA定位dCas9到基因组DNA上MUC16基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2‑P65‑HSF1，在定位点最大程度募集转录起始复合体，有效实现MUC16基因的原位转录激活；慢病毒系统能够把过表达的所需元件(MUC16‑sgRNA，dCAS‑VP64，MS2‑P65‑HSF1)整合到细胞的基因组DNA中，跟随细胞分裂复制，实现细胞株MUC16的稳定过表达；本发明实现了常规载体难以克隆的大分子糖蛋白MUC16的原位稳定过表达。

技术领域

本发明涉及一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，属于生物医药技术 领域。

背景技术

现有方法中，质粒载体多用于目的基因的瞬时过表达，由于质粒无法整合到 细胞基因组DNA中，目的基因会随着细胞分裂逐渐丢失。慢病毒载体可以把目 的基因整合到细胞基因组DNA中，实现稳定过表达。无论是利用质粒或病毒载 体实现过表达，都需要将目的基因序列克隆到载体中，通过增加基因拷贝数的方 式提高表达量，克隆片段的大小受载体的容量限制。如果目的基因的mRNA片 段过大，超出载体容量，则不能有效构建。例如：慢病毒载体目的基因的最大极 限是4kb左右。腺病毒载体的最大容量在5-8kb。腺相关病毒只能容纳小于3kb 的插入片段。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。一般情况下， 外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。MUC16是一个由 14507个氨基酸组成的大分子糖蛋白，分子量1519175Da，其mRNA长43816bp (相当于约43.8kb)。现有质粒载体和慢病毒载体不适于容纳如此大的目的基因。

Lenti-CRISPR-dCas9慢病毒过表达系统适用于蛋白编码基因和LincRNA， 其中dCas9代表无酶活的Cas9，不剪切基因组DNA。过表达系统包括两个重要 原件：dCAS-VP64，dCas9和转录激活结构域VP64的融合蛋白，以及 MS2-P65-HSF1，三个转录激活结构域的融合蛋白；两者都具备募集转录因子激 活表达的功能，二者协同能最大程度实现基因过表达。Lenti-CRISPR-dCas9慢病 毒系统利用sgRNA定位dCas9到基因组DNA上目标基因的启动子区，通过dCas9 融合的VP64结合MS2-P65-HSF1，在定位点最大程度募集转录起始复合体，有 效实现基因的原位转录激活。

发明内容

本发明的目的在于提供一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，使用 Lenti-CRISPR-dCas9系统从基因组DNA上目标基因的启动子区直接增强转录提 高表达量，无需大片段克隆构建，尤其适用于大基因的过表达，具体包括以下步 骤：

(1)sgRNA的设计：转录激活sgRNA的设计要求特异性的靶向目的基因 启动子区域，在目标物种基因组DNA上无其他结合位点；因为转录起始位点上 游200bp为转录激活的最佳区间，将此区域的碱基序列输入设计网站 CRISPRdirect，物种选择为智人作为参考基因组，得到能够靶向该区域的所有 sgRNA，从中筛选出特异性高的sgRNA序列用于载体构建。

MUC16过表达sgRNA的序列：SEQ ID NO.1；

MUC16-sgRNA-1：GGTTTCTAAGACATCACACA；

MUC16-sgRNA-2：AGGGAAGAATTGAGATCATC；

MUC16-sgRNA-3：TGAGATTTGGTCTTCTCAAT。

(2)使用BsmBI消化lenti sgRNA zeo backbone载体，胶回收纯化消化好 的载体；对sgRNA退火，将消化好的载体与退火sgRNA进行连接反应。

(3)步骤(2)得到的连接产物直接转化大肠杆菌Stbl3感受态，转化后的 菌液涂布于带氨苄抗性(100μg/mL)的LB培养平板；37度静置培养过夜。