[发明专利]一种促进骨髓间充质干细胞体外增殖的方法

说明书

本发明公开了一种促进骨髓间充质干细胞体外增殖的方法，包括在骨髓间充质干细胞原代培养的基础培养基中添加猴菇多糖、接骨木黄酮、石榴多酚，以培养基的终体积计，所述猴菇多糖的添加浓度为20‑35μg/mL，所述接骨木黄酮的添加浓度为50‑70μg/mL，所述石榴多酚的添加浓度为65‑80μg/mL。本发明提供一种促进骨髓间充质干细胞体外增殖的方法，选择在骨髓间充质干细胞原代培养的培养基中添加植物提取物猴菇多糖、接骨木黄酮、石榴多酚，刺激原代培养的细胞，提高细胞进行有丝分裂的活性，缩短细胞增殖的缓滞期，提高对数期细胞的增殖速度，从而大大增加用于传代培养的细胞数量，并且避免了在传代培养过程中添加外源性成分影响干细胞临床应用的问题，提高骨髓间充质干细胞的质量。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种促进骨髓间充质干细胞体外增殖的方法。

背景技术

干细胞的临床治疗需要合适的种子细胞。目前研究较多的胚胎干细胞是最早被分离得到的多能干细胞，体外培养可保持稳定增殖能力，具有向多个胚层方向分化的潜能。但是胚胎干细胞一般是来自于异源性组织的细胞，有免疫排斥的风险。自体组织中，骨髓中含有多中干细胞已被多次报道，且有多例临床报道骨髓干细胞移植可帮助治疗其他非造血系统疾病。

骨髓中除含造血干细胞外，还存在着一种具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化能力的多能干细胞即骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于骨髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。骨髓干细胞的可以分化成各种间充质来源的细胞，如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肝细胞、肌细胞、神经细胞等，是未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想种子细胞。

研究间充质干细胞体外扩增对骨组织工程的发展具有重要意义，骨组织工程的研究大多趋向于采用骨髓间充质干细胞作为种子细胞。但是和造血干细胞相比骨髓间充质干细胞的数量少，成人骨髓平均10万个有核细胞含有一个骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞采集数量有限，一般需在体外培养扩增20余天才能达到满足组织工程所需的细胞数量。且随着年龄的增加细胞的数量会逐渐减少，极大的限制了骨髓间充质干细胞在临床上应用。因此解决细胞快速扩增的问题是目前骨髓间充质干细胞临床应用的关键之一。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进骨髓间充质干细胞体外增殖的方法，通过在原代培养过程中添加猴菇多糖、接骨木黄酮、石榴多酚，提高原代培养过程中细胞的活跃度，缩短原代培养的时间，提高增殖效率。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种促进骨髓间充质干细胞体外增殖的方法，包括在骨髓间充质干细胞原代培养的基础培养基中添加猴菇多糖、接骨木黄酮、石榴多酚，以培养基的终体积计，所述猴菇多糖的添加浓度为20-35μg/mL，所述接骨木黄酮的添加浓度为50-70μg/mL，所述石榴多酚的添加浓度为65-80μg/mL。

上述促进骨髓间充质干细胞体外增殖的方法，包括以下步骤：

(1)提取分离人骨髓间充质干细胞，以1-2×10⁴个/mL在基础培养基中接种后进行原代培养，所述基础培养基中加入猴菇多糖、接骨木黄酮、石榴多酚、胎牛血清，以培养基的终体积计，所述猴菇多糖的添加浓度为20-35μg/mL，所述接骨木黄酮的添加浓度为50-70μg/mL，所述石榴多酚的添加浓度为65-80μg/mL，所述胎牛血清的用量为培养基终体积的5-10％，在37℃、5％CO₂的条件下培养，每2-3天更换培养基，至细胞融合度达到80％-85％，用胰酶消化传代；

(2)取上述步骤(1)中胰酶消化后的细胞以1-2×10⁵个/mL接种于完全培养基中，进行传代培养，传代培养过程在37℃、5％CO₂的条件下进行，每隔3d全量换培养液。