[发明专利]粗品多糖的纯化方法

说明书

本发明属于微生物技术领域，具体的涉及一种粗品多糖的纯化方法。由洗脱浓度的确定、阴离子交换纯化和凝胶柱层析三大步骤组成；通过阴离子交换纯化获得初步分离的多糖，然后经凝胶柱层析获得纯品多糖。本发明所述的粗品多糖的纯化方法，纯化程度高，方法简单可行，反应条件温和，纯化设备投入成本低；阴离子交换色谱与凝胶色谱相互配合，使粗多糖的分离更为精细。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体的涉及一种粗品多糖的纯化方法。

背景技术

真菌多糖是从真菌菌丝体、发酵液、孢子及其子实体中分离出来的天然大分子物质。真菌多糖均有抗癌症、抗寄生虫、免疫调节、抗疲劳等多种生物学功能，是重要的天然药用活性成分及保健品。

多糖常用的提取方法有热水浸提法、烯酸、烯碱浸提法、微波辅助浸提法和超声波辅助浸提法。想要在所提取的多糖中获取均一成分的多糖则需要对所提取的不同种类的多糖进行分级纯化，主要包括以下几种方法：分级沉淀法，包括季铵盐沉淀法和有机溶剂沉淀法；色谱分离法，包括离子交换色谱、纤维柱色谱、凝胶柱色谱等；膜分离法及制备性区域电泳法等纯化方法。其中，应用范围较广而且简便易操作的方法是利用乙醇对多糖的溶解度不同进行分离，通过将乙醇加入至所提粗多糖的饱和水溶液中，使乙醇的最终浓度不同，可将粗多糖分成几个等级，均一多糖还需要应用色谱、电泳、超滤等技术进行分级并纯化。

多糖粗提取物往往是复杂的混合物，包括分子量不同、结构不同的多糖片段，因此需要纯化处理，现有的纯化方法多是采用单一的色谱分离技术，使得粗品多糖无法完全分离，因此，有必要探索出一套新型的粗品多糖的纯化方法。

发明内容

本发明的目的是：提供一种粗品多糖的纯化方法。该方法纯化程度高，方法简单可行，反应条件温和，纯化设备投入成本低。

本发明所述的粗品多糖的纯化方法，由以下步骤组成：

(1)洗脱浓度的确定：将红曲霉粗品多糖用去离子水配成浓度为40-50mg/mL的多糖溶液，利用阴离子交换色谱柱进行梯度洗脱，选用不同浓度的NaCl溶液为洗脱液，收集到的样品溶液以硫酸-苯酚法测定吸光度值，并以吸光度值和NaCl浓度对洗脱体积作图，确定洗脱液浓度；

(2)阴离子交换纯化：利用阴离子交换色谱柱对粗品多糖进行纯化，然后将洗脱液透析除盐、浓缩后冷冻干燥即得初步分离的多糖；

(3)凝胶柱层析：将初步分离的多糖配制成70-80mg/mL的样品溶液，上样至凝胶色谱柱，采用NH₄HCO₃溶液进行洗脱，洗脱液通过自动部分收集器收集，通过硫酸-苯酚法检测各管吸光度，以吸光度对洗脱体积绘制洗脱曲线，收集相应峰尖部分，反复加水减压干燥去除NH₄HCO₃，冷冻干燥后即得纯品多糖。

其中：

步骤(1)中所述的NaCl溶液的浓度为0mol/L、0.025mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L和2mol/L。

步骤(1)中所述的控制洗脱流速为2-3mL/min，使用自动部分收集器收集，每个梯度20-25管，每管样品量为5-6mL。

步骤(1)所述的硫酸-苯酚法是以葡萄糖为标准品，由以下两步组成：