[发明专利]一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因及其应用

说明书

本发明涉及一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因，该基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1770位所示的核苷酸序列。本发明还公开了该基因在制备重组乙酰胆碱酯酶方法的应用。本发明利用基因工程手段，将家蝇Ache基因编码区插入到酵母表达载体中，并转化毕赤酵母表达菌株，筛选出了高表达的基因工程菌株，用甲醇进行诱导后实现了Ache蛋白在毕赤酵母中的过量表达，从而为工业发酵生产乙酰胆碱酯酶提供了高效方法。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因及其应用。

背景技术

我国是农业生产大国，同时也是世界上农药使用量最大的国家。据统计，我国平均每年生产化学农药约100万吨，仅次于美国居世界第二。我国又是农药使用大国，平均每年防治面积为49亿亩次。然而，由于农药滥用及监管的不到位，农副产品中农药残留问题普遍存在，严重影响了人类身体健康，直接降低了我国食品安全水平和大宗农产品出口的国际竞争力。由于病虫害耐药性的产生，农药的品种和用量也与日俱增，这对土壤、大气和水体的污染、对环境质量影响与破坏是严重的。

农药残留已成为环境和食品污染的主要原因之一，特别是有机磷和氨基甲酸酯类农药对人类具有高毒性。有机磷、氨基甲酸酯类农药因具有防治谱广、价格低廉、种类多等特点而被广泛用于各种农作物的生产。这两类农药残留的危害主要有以下几点：

①危害人体健康。有机磷、氨基甲酸酯类农药具有致畸性、致癌性、致突变性，对人类和其它哺乳动物危害大，可以降低免疫能力并诱发肿瘤，对胎儿的发育有明显的抑制作用，损害神经系统等。近年来，有机磷、氨基甲酸酯类农药导致男性不育率明显增加。

②严重污染环境。对环境的污染途径主要是田间施用，有机磷、氨基甲酸酯类农药施到田间，只有1%~2%的农药作用于病虫害，10%~20%的农药附着在农作物表面，其余部分进入环境，对土壤、水体和空气造成污染。其次，未使用农药和农药包装物的随意丢弃、农药工厂意外泄露和废水排放都会造成周围环境的污染。

③影响出口经济贸易。农药残留是很多国家设置贸易“绿色壁垒”的重要手段。由于我国农产品有机磷农药残留超标，我国农产品出口严重受阻。近几年欧盟对我国茶叶中农药残留的规定项目不断增多，有机磷类农药已被许多国家列为最先接受登记和残留限量再评价的一类农药，这些规定严重阻碍了我国农产品的出口贸易。

④破坏生态平衡。有机磷和氨基甲酸酯类农药的大量施用，破坏了天敌与害虫之间的生态平衡，其导致害虫耐药性不断增加及天敌数量下降。农药残留导致土壤中生物多样性降低，使生产能力下降。农药进入水体后会在水生生物体内富集，严重时会引起生物大面积死亡。

目前，有机磷、氨基甲酸酯类农药残留的检测主要分为仪器分析法和生物法两大类。这两类方法对设备及相应操作要求极高、检测过程复杂、周期长、成本高、不能及时显示结果，难以普及至日常民用。而且，食品中很多是鲜活农产品，这就需要一种更快、更精准的快速的农药残留筛查方法。

国外利用酶抑制法快速检测农产品中农药残留，其原理是基于有机磷、氨基甲酸酯类农药可特异性地抑制昆虫中枢神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性而使昆虫中毒致死。因此，可以通过农药对乙酰胆碱酯酶活性的抑制来检测农药的残留情况，一般是通过抑制率判断样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在及其含量的多少。酶抑制法能在10 min~30min内快速测定蔬菜中有机磷、氨基甲酸酯类农药残留，现已成为国内外快速检测农药残留的主流技术。因此，提高乙酰胆碱酯酶表达效率对酶抑制法检测农残有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供该修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因的应用。