[发明专利]一种基于猪瘟病毒基因的核酸和重组蛋白共免疫疫苗、制备方法及应用

权利要求书

1.一种基于猪瘟病毒基因的核酸和重组蛋白共免疫疫苗，其特征在于，所述共免疫疫苗包括双相佐剂，和，分布于双相佐剂不同液相层的核酸和重组蛋白，所述核酸包括编码猪瘟病毒抗原蛋白结合位点的序列，所述重组蛋白包括猪瘟病毒抗原蛋白结合位点的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的基于猪瘟病毒基因的核酸和重组蛋白共免疫疫苗，其特征在于，所述的猪瘟病毒抗原蛋白包括E2和/或E0蛋白。

3.根据权利要求1所述的基于猪瘟病毒基因的核酸和重组蛋白共免疫疫苗，其特征在于，所述的核酸与重组蛋白的质量比为1∶(1.5～4.5)；

优选地，所述的核酸与重组蛋白的质量比为1：(2～4)；

优选地，所述的核酸与重组蛋白的质量比为1:2.5。

4.根据权利要求1所述的基于猪瘟病毒基因的核酸和重组蛋白共免疫疫苗，其特征在于，所述双相佐剂包括水相层，所述水相层的层数至少为两层；

优选地，所述双相佐剂的组成包括如下任一种：

(a)至少一种水包油包水佐剂；

(b)至少两种油包水佐剂；

(c)至少一种水包油包水佐剂和至少一种油包水佐剂；

优选地，所述双相佐剂包括ISA 201VG、ISA 563VG、ISA 206VG或ISA 660VG中的至少一种；

优选地，所述核酸和重组蛋白分别分布于不同的水相层。

5.权利要求1-4任一项所述的基于猪瘟病毒基因的核酸和重组蛋白共免疫疫苗的制备方法，其特征在于，将包括编码猪瘟病毒抗原蛋白结合位点的核酸和重组蛋白分别复配入双相佐剂的不同液相层中，得到核酸和重组蛋白共免疫疫苗。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的核酸包括以编码猪瘟病毒抗原蛋白的核酸序列为目的基因构建的重组质粒；

优选地，所述重组质粒包括编码猪瘟病毒抗原蛋白E2和/或E0蛋白结合位点的核酸序列；

优选地，选用真核表达质粒进行重组质粒的构建；

进一步优选地，所述真核表达质粒包括质粒pcDNA3.1。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括在重组质粒构建之前，首先对编码猪瘟病毒抗原蛋白的核酸序列进行密码子的修饰，形成重组核酸序列；

优选地，所述的修饰还包括，所述编码猪瘟病毒抗原蛋白的核酸序列5’端插入信号肽序列；和/或，去除所述编码猪瘟病毒抗原蛋白的核酸序列3’端跨膜区序列片段；和/或，所述编码猪瘟病毒抗原蛋白的核酸序列3’端插入CpG序列；

优选地，所述CpG序列包括CpG19和CpG2395序列；

优选地，所述的修饰还包括，所述编码猪瘟病毒抗原蛋白的核酸序列3’端末位插入组氨酸标签；

优选地，所述的修饰还包括，所述编码猪瘟病毒抗原蛋白的核酸序列5’端信号肽序列之前插入Kozak序列；

进一步优选地，所述Kozak序列为GCCACC；

优选地，所述重组核酸序列如SEQ ID No.1所示，其中1-6位为Kozak序列，7-72位为信号肽序列，73-1110为密码子修饰、截短的E2基因，1111-1278为CpG序列，1279-1296为His标签序列；

优选地，所述的重组核酸序列的两端插入酶切位点。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括，将所述的重组质粒转染入细胞株后表达得到包括重组蛋白和重组质粒的表达产物，而后分别对产物中的重组蛋白和重组质粒进行分离与纯化；

优选地，所述细胞株包括CHO细胞；

优选地，所述CHO细胞包括CHO-S或CHO-K1细胞；

优选地，所述转染的方法包括脂质体转染法；

优选地，采用层析法对重组蛋白进行分离与纯化；

优选地，采用试剂盒提取法对重组质粒进行分离与纯化。