[发明专利]一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法

说明书

本发明公开了一种对卵巢癌的Anti‑MUC16 CAR‑T细胞，包括，Anti‑MUC16的单链抗体的核酸序列、CD8跨膜区核酸序列，4‑1BB胞内信号区核酸序列、CD3Z胞内信号区核酸序列、IL‑12核酸序列。还提供了制备该细胞的方法，（1）Anti‑MUC16 CAR嵌合抗原受体的载体合成；（2）病毒包装及慢病毒滴度的测定；（3）Anti‑MUC16 CAR‑T细胞的制备；（4）Anti‑MUC16 CAR‑T细胞的功能检测。其优点在于，本发明选取抗MUC16特异性跨膜区表位的抗体，结合目前CAR‑T基因手段，制备出能够特异性识别和杀伤卵巢肿瘤的T细胞，有希望为卵巢癌的治愈提供一个新的治疗方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法。

背景技术

卵巢癌是一种常见的恶性肿瘤，在全世界范围内致死率较高，由于患者在前期没有明显临床症状，临床缺乏确定的检验手段，通常在确诊时候肿瘤已经恶化，导致该疾病治疗难度大、治愈率较低。MUC16是一种高分子量糖蛋白，是一种跨膜蛋白，目前有科学家认为MUC16是早期诊断卵巢癌的重要肿瘤指标，并广泛应用于临床。近来研究发现，MUC16的异常过表达与卵巢癌的不良预后和发生发展密切相关，MUC16通过与间皮素结合促进卵巢癌远处转移，并且通过抑制肿瘤细胞和免疫细胞形成免疫突触帮助卵巢癌细胞实现免疫逃逸。从而MUC16在卵巢癌中的过表达促进肿瘤细胞的增殖、迁移和转移，促进卵巢癌的发生发展。

嵌合抗原受体T细胞(Chimericantigen receptor T cell,简称：CAR-T)是目前免疫细胞治疗技术常用方法之一，通过提取患者体内的T淋巴细胞，将T淋巴细胞在体外进行基因整合修饰，使T淋巴细胞带有能识别肿瘤细胞并能同时激活T淋巴细胞的嵌合抗体，被改造培养的T细胞进行大量扩增并回输到病人体内，改造的T细胞获得特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力，精准的杀伤肿瘤细胞，最终达到清除肿瘤的效果。但修饰的T细胞可能会表现出过度的活性，导致一些临床副作用和毒性。

如何能够得到特异性识别和精准杀伤，尽量减少副作用和毒性。是本领域技术人员一致探索的方向。

发明内容

为解决现有技术中针对卵巢癌提供一种精准杀伤、尽量减少副作用和毒性的治疗方法的问题，本发明公开了一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法，实现的目的为本发明选取抗MUC16特异性跨膜区表位的抗体，结合目前CAR-T基因手段，制备出能够特异性识别和杀伤卵巢肿瘤的T细胞，有希望为卵巢癌的治愈提供一个新的治疗方法。

为了实现上述目的，本发明公开的技术方案为：本发明提供的一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞，该细胞包括，Anti-MUC16的单链抗体的核酸序列、CD8跨膜区核酸序列，4-1BB胞内信号区核酸序列、CD3Z胞内信号区核酸序列、IL-12核酸序列，所述各核酸序列依次见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

进一步的，本发明还提供了制备所述CAR-T细胞的方法，包括如下步骤：(1)Anti-MUC16-CAR嵌合抗原受体的载体合成：编码Anti-MUC16的单链抗体的核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.1，编码CD8跨膜区核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.2，编码4-1BB胞内信号区核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.3，编码CD3Z胞内信号区核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.4，编码IL-12核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.5，将scFV-CD8-4-1BB-CD3Z-IL12引进合成到慢病毒表达载体pCDH载体上，通过测序鉴定，从而完成对嵌合抗原受体慢病毒表达载体的构建；

(2)病毒包装及慢病毒滴度的测定：