[发明专利]一种双功能口蹄疫免疫增强剂及其制备方法和应用

说明书

本发明公开O‑羧甲基‑N‑胍基壳聚糖，本发明还公开双功能免疫增强剂，双功能免疫增强剂含有O‑羧甲基‑N‑胍基壳聚糖10~500μg/mL、胞壁酰二肽10‑100μg/mL、磷酸三苯酯4~30mg/mL、透明质酸1‑6μg/mL和黄芪多糖0.2~2mg/mL。本发明还公开双功能免疫增强剂的制备方法及其应用。本发明还公开双功能免疫增强剂的口蹄疫疫苗及其制备方法。该免疫增强剂与口蹄疫灭活疫苗混合后使用可以有效的提高疫苗的效力，在免疫后3天能够检测到较高水平的细胞因子，免疫后7天能够产生高水平的液相阻断抗体。该免疫增强剂不但可以提高疫苗免疫后的体液免疫反应，而且能够显著提高疫苗免疫后的细胞免疫水平。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种双功能口蹄疫免疫增强剂及其制备方法和应用。

背景技术

口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒引发的偶蹄兽的急性、烈性的传染病，OIE将其列为A类疫病，在我国也作为一类传染病对其进行防控。疫苗免疫是控制和预防该病的主要手段，但当前口蹄疫疫苗在使用中存在疫苗免疫后抗体产生慢、抗体水平低、抗体持续期短及对变异毒株保护力差的缺点。

针对现有口蹄疫灭活疫苗存在的问题，在不改变现有疫苗制造工艺的前提下，通过添加免疫增强剂，提高疫苗免疫后的抗体水平，进而优化现有疫苗的免疫效力。为了进一步降低免疫增强剂的制备成本，并提高免疫增强剂的靶向性，进一步进行免疫增强剂的配方优化。机体的体液和细胞免疫反应是抵抗外来微生物入侵的重要保障。自组装纳米颗粒免疫增强剂是由动物免疫工程研究所免疫技术研究室制备的新型免疫增强剂，由黄芪多糖，磷酸三苯酯，透明质酸，胞壁酰二肽逐步添加后获得。自主装纳米颗粒免疫增强剂已被证实可以显著提高现有疫苗的抗体水平和抗体持续期。但是没有有效的细胞免疫产生，因此在优化配方的试验中，侧重评价细胞免疫的效力，在优化配方的基础上通过添加壳聚糖，不仅能够刺激机体早期产生抗体、而且能够显著提高疫苗免疫后的体液和细胞免疫水平，有利于在存在病毒感染时，对病毒的有效清除。

壳聚糖(chitosan)是甲壳素的主要衍生物，广泛存在于低等动物特别是节肢动物的外壳中以及低等植物如真菌、藻类的细胞壁中，易于获得。同时壳聚糖也是被FDA批准的可用于食品、药品、疫苗的物质，具有无毒性、生物可降解性和良好的生物相容性。壳聚糖作为佐剂能够增强巨噬细胞和多核细胞的聚集和活化、能够增强机体抵抗病原微生物的能力。因此，以原有口蹄疫灭活疫苗免疫增强剂作为优化对象，进行壳聚糖的筛选，设计一种双功能口蹄疫免疫增强剂，即可有效的提高现有疫苗的免疫效力，又可以改善现有疫苗免疫后的细胞免疫水平，为后续研究提供新的思路和选择。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种双功能免疫增强剂。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的双功能免疫增强剂的制备方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了含有所述的双功能免疫增强剂的口蹄疫疫苗。

本发明还要解决的技术问题是提供了含有所述的双功能免疫增强剂的口蹄疫疫苗的指标方法。

技术方案：为了解决上述问题，本发明提供了O-羧甲基-N-胍基壳聚糖，所述O-羧甲基-N-胍基壳聚糖结构式为：其中，n为改性壳聚糖的糖单元总数，m为O-羧甲基-N胍基的糖单元个数。其中，m是25000-30000，n是20000-25500。

本发明内容还包括所述的O-羧甲基-N-胍基壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：

1)O-羧甲基壳聚糖的制备：取壳聚糖(购自酷尔化学科技(北京)有限公司)，加入NaOH水溶液，室温搅拌过夜，然后加入异丙醇搅拌，分多次将氯乙酸异丙醇溶液滴加到溶液中，搅拌；反应结束后，甲醇洗涤，产物溶于水中，抽滤除不溶物，透析，冻干，得O-羧甲基壳聚糖；