[发明专利]一种基于细胞朝向的定量去核方法

说明书

本发明涉及一种基于细胞朝向的定量去核方法，包括以下步骤：S1，对细胞核抽取过程有限元建模确定去核所需胞质去除量在关于细胞核‑微针相对位置下的分布；S2，对细胞核进行染色在荧光场下定位细胞核相对于极体的三维分布范围；S3，结合以上两步结果确定一个极体在焦平面上点位作为去核操作时的细胞朝向；S4，转动细胞至该方向吸取定量胞质进行去核。本发明利用细胞核抽取过程的有限元建模与离线确定的细胞核相对于极体三维分布范围确定去核时的极体点位，自动控制胞质去除量，可实现10％去核量下96％的去核成功率。

技术领域

本发明涉及细胞级别的显微操作领域，具体涉及一种基于细胞朝向的定量去核方法。

背景技术

细胞去核在指将受体卵母细胞中含有遗传物质的细胞核去除的操作，是克隆操作的关键步骤。在细胞去核过程中过多的损失胞质会使克隆胚胎失去过多的营养物质，继而导致胚胎发育失败或降低胚胎发育潜力。因此去核操作中在细胞核完全去除的前提下应该尽可能减少胞质量去除量。

目前，现有的细胞去核操作主要有以下几种方式：(1)使用特殊化学物质浸泡去核；(2)激光、X光或紫外线照射细胞核的部位，使细胞核丧失功能；(3)使用磁力驱动微刀片或者微流道对细胞进行二分切割去核；采用以上三种常用方式对细胞进行去核时，主要存在以下缺陷：a、特殊化学物质浸泡细胞实现功能性去核时，遗留的化学物质会对后续引入的供体基因的表达不利；b、X光、激光照射细胞核区域会使得细胞基因丧失表达能力，且激光和X光产生的能量会破坏细胞核周围的胞质活性，降低克隆胚胎发育潜力；c、使用磁力驱动微刀片或者微流道对细胞进行二分切割，抛弃含有细胞核的那一半也可以去核，但巨大的胞质损失使其难以应用到克隆操作中。

为了减少细胞去核操作对细胞本身的伤害。目前，主要采用显微镜下，控制微针抽取细胞核，具体方法为：操作者在显微镜下使用吸持针固定卵母细胞，控制斜口微针从三点钟方向刺入卵母将细胞核吸取出来。但是，这种去核方法，在实际应用过程中，主要存在以下问题：由于家畜卵母细胞胞质颜色较深，埋藏在胞质内的细胞核一般不可见。采用荧光染色虽然可以使细胞核可见，但荧光场下无法对微针位置与胞质去除量进行计算，使得微针运动控制与去核体积控制难以进行。

经研究表明，在MII期细胞核一般位于第二极体附近，通过调整极体在显微镜下焦平面上的点位(即：细胞的朝向)，使细胞核在微针刺入细胞之后能够离针口近一些，从理论上可以实现以抽取较少的胞质就可以将细胞核吸入针管。然而，由于较小去核量完成去核所需的细胞核-斜口微针相对位置与细胞核相对于极体的三维分布均未可知，因此，很难确定一个具体的极体点位作去核时的最佳细胞朝向。所以，开发一种去核方法确定合适的细胞朝向，并基于该细胞朝向实现以较少胞质完成完全去核十分有必要。

发明内容

为了实现去核操作中在细胞核完全去除的前提下尽可能减少胞质量去除量，本发明提出了一种基于细胞朝向的定量去核操作方法，该方法利用胞质吸取过程有限元建模确定以较少胞质去除量完成去核的细胞核相对微针的位置范围以及标定细胞核相对极体的三维分布范围，利用几何关系计算获得定量去核所需的极体点位作为去核中的细胞朝向完成卵母细胞去核。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种基于细胞朝向的定量去核方法，包括以下步骤：

S1，通过对细胞核抽取过程进行有限元建模，获得微针针管周围不同潜在细胞核位置处在细胞核抽取过程中完成去核所需胞质去除量的分布，并确定以较少胞质去除量完成去核的细胞核相对微针的位置范围；

S2，在离线条件下，对荧光染色细胞核进行三维定位，并与在明场下确定的极体三维位置进行对比，获得细胞核相对于极体的三维分布范围；

S3，利用几何关系计算得到胞质去除量较少时，极体在焦平面上的点位角θ，并将该焦平面上的极体点位作为细胞去核过程中细胞的朝向；

S4，拨动细胞将极体转动到所述焦平面上设定点位，定量控制胞质去除量进行细胞去核。