[发明专利]基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法

权利要求书

1.一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将生物墨水、MSC悬浮液和小鼠足趾部真皮基质匀浆通过3D打印技术进行打印得到含MSC的3D打印基质；

(2)将含有MSC的3D打印基质进行交联；

(3)将交联后3D打印基质进行培养获得汗腺细胞；

其中，生物墨水的杨氏模量为160-380kPa，且孔隙率为0.5-0.7。

2.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，步骤(1)的含MSC的3D打印基质的制备方法如下：取体积比为2:0.25-2:18的浓度为1.0×10⁷cell/ml的MSC悬浮液、小鼠足趾部真皮基质匀浆和生物墨水混合均匀后密封在无菌打印注射器中，将密封后的无菌打印注射器放置在4℃冷却15-30min后，将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上，设置温度为15℃，同时将培养皿放在3D生物打印平台，设置温度为4℃，使用打印喷嘴构建含MSC的3D打印基质，即得载有MSC的3D打印基质。

3.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，步骤(2)所述将含有MSC的3D打印基质进行交联的具体方法为：将载有MSC的3D打印基质用浓度为2％-3％的氯化钙溶液交联8-12min，氯化钙溶液浸没3D打印基质。

4.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，步骤(3)进行培养获得汗腺细胞具体包括以下步骤：先将交联后的载有MSC的3D打印基质用DMEM培养基培养3天，3天后再用汗腺专用培养基培养，所述DMEM培养基和所述汗腺专用培养基均是每两天更换一次；培养基培养的条件为放置于37℃，5％CO₂的无菌培养箱中培养。

5.如权利要求4所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，所述DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入5-15％(v/v)的胎牛血清FBS，0.8-1.2％(v/v)双抗溶液，所述双抗溶液为青霉素-链霉素混合液。

6.如权利要求4所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，所述汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例混合，充分混匀后加入1-3ng/mL三碘甲状腺原氨、4-6％(v/v)胎牛血清FBS、8-12ng/mLEGF、0.3-0.5μg/mL半琥珀酰氢化考的松、0.8-1.2％(v/v)双抗溶液和0.8-1.2mL/100mLITS，所述双抗溶液为青霉素-链霉素混合液。

7.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，所述生物墨水通过以下方法制备而成：

称取3.5-4.5重量份的海藻酸钠和9-11重量份的明胶均匀混合，置入装有90-110重量份的超纯水中搅拌均匀制得海藻酸钠-明胶混悬液；待海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸钠和明胶完全溶解于超纯水时，制得生物墨水。

8.如权利要求7所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，所述海藻酸钠与所述明胶、超纯水的质量比为4:10:100。

9.如权利要求7所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，将海藻酸钠与明胶置入超纯水中搅拌均匀后，还包括以下步骤：将海藻酸钠-明胶混悬液于40-80℃条件下放置8-20小时，即可使海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸钠和明胶完全溶解于超纯水中。

10.如权利要求7所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸钠和明胶完全溶解于超纯水后还包括以下步骤：将打印基质通过巴氏消毒法灭菌，灭菌条件为：在60-80℃条件下灭菌10-60分钟；再在1-8℃条件下灭菌3-10分钟，循环交叉灭菌3次。