[发明专利]4-氯邻苯二酚降解基因簇的优化重组与应用

说明书

本发明公开了一种优化后适用于大肠杆菌表达的4‑氯邻苯二酚降解相关的基因簇及其应用。该基因簇包含四个基因，每个基因都由独立的T7启动子和终止子控制，其核苷酸序列分别如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2、SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID No 5、SEQ ID No 6、SEQ ID No 7和SEQ ID No 8所示。本发明优化合成的基因能够在大肠杆菌中成功表达，表达这个基因簇的大肠杆菌不仅能够降解4‑氯邻苯二酚，还能够降解邻苯二酚和3‑氯邻苯二酚，因此该基因簇可用于制备降解邻苯二酚，3‑氯邻苯二酚和4‑氯邻苯二酚的微生物。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及结构优化的、包含4-氯邻苯二酚降解相关四个基因的基因簇序列。

背景技术

随着化学工业的高速发展，人工合成的各种自然界中本不存在的有机物日益增多。氯代芳香族化合物是由芳香烃及其衍生物上的一个或几个氢原子被氯原子取代后生成的，主要包括氯苯、氯酚、多氯联苯等。它们广泛应用于工农业生产过程中，但也不可避免的会进入环境造成污染。它们大多具有毒性，对生物具有致癌、致畸、致突变作用，是一类重要的环境污染物。

微生物对外来化合物的降解或转化具有巨大的应用潜力。由于氯代芳香族化合物多为人工合成，自然界中的微生物缺乏降解相关的酶。但它们通过长期的自然驯化，通过遗传变异，逐渐改变自身特性、适应外部环境的变化，产生新的酶系来获得新的代谢功能，因此引起了国内外研究者的广泛兴趣。通过生物处理将有毒物质转化为无毒物质，投资少、成本低、且无二次污染是近年来污染修复相关研究的热点。

研究发现，微生物对氯代芳香族化合物的降解，受氯原子取代的位置和数量影响，降解途径也存在明显差异，而部分氯代芳香族化合物的降解都能够先通过不同的代谢途径转化为3-氯邻苯二酚或4-氯邻苯二酚，再经过相同或相似的途径打开苯环，最终进入三羧酸循环为微生物所利用。例如，有研究发现，4-氯邻苯二酚是一种伯克氏菌(Burkholderiasp. RKJ 800)降解4-氯,2-氨基酚途径中的重要中间代谢产物（Environ Sci Pollut ResInt, 21(2014) :2298-2304）。

虽然，不断有新的能够降解氯代芳香族化合物的微生物被分离与鉴定。但面对复杂多样的生物修复需求，可供选择的降解微生物仍十分有限。通过生物技术手段，有目的的改造合适的微生物，使它们获得相应的生物修复能力，是一种可行的解决方案。为高效降解氯代芳香族化合物、修复污染场地、开发新的有机污染生物控制技术奠定技术基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供能够在大肠杆菌中表达的4-氯邻苯二酚降解基因簇，包含四个相关基因：

ccaA基因，编码氯代邻苯二酚1,2双加氧酶；

ccaB基因，编码氯代粘康酸环异构酶；

ccaC基因，编码二烯内酯水解酶；

ccaD基因，编码己烯二酸还原酶。